Isolering og kvantificering af Epstein-Barr-virus fra P3HR1-cellelinjen

Summary

Denne protokol tillader isolering af Epstein-Barr-viruspartikler fra den humane P3HR1-cellelinje ved inducering af den virale lytiske cyklus med phorbol 12-myristat 13-acetat. DNA ekstraheres efterfølgende fra det virale præparat og udsættes for PCR i realtid for at kvantificere den virale partikelkoncentration.

Abstract

Epstein-Barr-viruset (EBV), formelt betegnet som Human herpesvirus 4 (HHV-4), er den første isolerede humane tumorvirus. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af EBV. Med de seneste fremskridt inden for molekylærbiologi og immunologi har anvendelsen af både in vitro- og in vivo-eksperimentelle modeller givet dyb og meningsfuld indsigt i patogenesen af EBV i mange sygdomme såvel som i EBV-associeret tumorigenese. Formålet med dette visualiserede eksperimentpapir er at give et overblik over isoleringen af EBV-virale partikler fra celler i P3HR1-cellelinjen efterfulgt af kvantificering af det virale præparat. P3HR1-celler, oprindeligt isoleret fra et humant Burkitt-lymfom, kan producere en P3HR1-virus, som er en type 2 EBV-stamme. EBV-lytisk cyklus kan induceres i disse P3HR1-celler ved behandling med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), hvilket giver EBV-virale partikler.

Ved anvendelse af denne protokol til isolering af EBV-partikler dyrkes P3HR1-celler i 5 dage ved 37 °C og 5% CO₂ i komplet RPMI-1640-medium indeholdende 35 ng/ml PMA. Derefter centrifugeres kulturmediet med en hastighed på 120 x g i 8 minutter for at pelletere cellerne. Den virusholdige supernatant opsamles derefter og spindes ned med en hastighed på 16.000 x g i 90 minutter for at pelletere EBV-partiklerne. Den virale pellet resuspenderes derefter i et komplet RPMI-1640-medium. Dette efterfølges af DNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR for at vurdere koncentrationen af EBV-partikler i præparatet.

Introduction

Epstein-Barr-virussen (EBV) er den første humane tumorvirus, der er blevet isoleret¹. EBV, formelt benævnt Human herpesvirus 4 (HHV-4)², er en del af gamma herpesvirus underfamilien af herpesvirusfamilien og er prototypen af Lymphocryptovirus-slægten. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af virussen³. I de fleste tilfælde forekommer indledende infektion inden for de første 3 år af livet og er asymptomatisk, men hvis infektion opstår senere i ungdomsårene, kan det give anledning til en sygdom kaldet infektiøs mononukleose⁴. EBV er i stand til at inficere hvilende B-celler, der får dem til at blive proliferative B-lymfoblaster, hvor virussen etablerer og opretholder en latent inficeret tilstand⁵. EBV kan genaktiveres når som helst og dermed føre til tilbagevendende infektioner⁶.

I løbet af de sidste 50 år er sammenhængen mellem nogle vira og udviklingen af menneskelige maligniteter blevet mere og mere tydelig, og i dag anslås det, at 15% til 20% af alle humane kræftformer er relateret til virusinfektioner⁷. Herpesvirus, herunder EBV, er nogle af de bedst undersøgte eksempler på disse typer tumorvirus⁸. Faktisk kan EBV forårsage mange typer humane maligniteter, såsom Burkitt lymfom (BL), Hodgkin lymfom (HL), diffust stort B-celle lymfom og lymfoproliferative sygdomme hos immunkompromitterede værter ^9,10. EBV har også vist sig at være forbundet med udviklingen af systemiske autoimmune sygdomme. Nogle eksempler på disse autoimmune lidelser er reumatoid arthritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemisk lupus erythematosus (SLE), blandet bindevævssygdom (MCTD) og Sjögrens syndrom (SS)¹¹. EBV er også forbundet med udviklingen af inflammatorisk tarmsygdom (IBD)¹².

Mange af disse sygdomme kan studeres eller modelleres ved hjælp af cellekultur, mus eller andre organismer, der er inficeret med EBV. Derfor er EBV-partikler nødvendige for at inficere celler eller organismer, hvad enten det er in vitro eller in vivo-modeller ^13,14,15,16, og derfor er det nødvendigt at udvikle en teknik, der tillader isolering af virale partikler til en lav pris. Den protokol, der er beskrevet her, giver retningslinjer for en nem måde at pålideligt isolere EBV-partikler fra en relativt tilgængelig cellelinje og kvantificere partiklerne ved hjælp af realtids-PCR, som er omkostningseffektiv og let tilgængelig for de fleste laboratorier. Dette er i sammenligning med flere andre metoder, der er beskrevet for at isolere EBV fra forskellige cellelinjer^17,18,19,20.

P3HR-1 er en BL-cellelinje, der vokser i suspension og er latent inficeret med en EBV type 2-stamme. Denne cellelinje er en EBV-producent og kan induceres til at producere virale partikler. Målet med dette manuskript er at fremvise en metode, der tillader isolering af EBV-partikler fra P3HR-1-cellelinjen, efterfulgt af kvantificering af den virale bestand, der senere kan bruges til både in vitro – og in vivo EBV-eksperimentelle modeller.

Protocol

BEMÆRK: EBV bør betragtes som et potentielt biofarligt materiale og bør derfor håndteres under biosikkerhedsniveau 2-indeslutning eller højere. En lab frakke samt handsker skal bæres. Hvis der er potentiale for udsættelse for stænk, bør øjenbeskyttelse også overvejes. Følgende procedure skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab. 1. Optælling af P3HR1-cellerne Centrifugering og resuspending cellerCellesuspensionen overføres fra en 100 mm kultur…

Representative Results

Målet med denne procedure er at isolere EBV-partikler i en suspension med kendt viral titer, som efterfølgende kan bruges til at modellere EBV-infektion. Det er derfor yderst vigtigt at anvende optimale koncentrationer af de forskellige reagenser for at opnå det højeste EBV-udbytte ud af proceduren. Et optimeringsforsøg blev udført for at bestemme koncentrationerne af PMA og DMSO, der ville give det højeste antal EBV-partikler (figur 2). En DMSO-koncentrati…

Discussion

Produktionen af EBV-partikler er nødvendig for at forstå biologien af denne virus såvel som dens tilknyttede sygdomme. Her beskrev vi produktionen af disse partikler fra P3HR-1 cellelinjen. Denne cellelinje er ikke den eneste EBV-producentlinje; faktisk er EBV-partikler også blevet isoleret fra B95-8 celler^21,22 samt Raji-cellelinjen^18,19. EBV-lytisk cyklus er blevet induceret i disse celler med n-bu…

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121