Isolement et quantification du virus d’Epstein-Barr à partir de la lignée cellulaire P3HR1

Summary

Ce protocole permet d’isoler les particules du virus d’Epstein-Barr de la lignée cellulaire humaine P3HR1 lors de l’induction du cycle lytique viral avec le phorbol 12-myristate 13-acétate. L’ADN est ensuite extrait de la préparation virale et soumis à une PCR en temps réel pour quantifier la concentration de particules virales.

Abstract

Le virus d’Epstein-Barr (EBV), officiellement désigné comme herpèsvirus humain 4 (HHV-4), est le premier virus tumoral humain isolé. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le VEB. Avec les progrès récents de la biologie moléculaire et de l’immunologie, l’application de modèles expérimentaux in vitro et in vivo a fourni un aperçu approfondi et significatif de la pathogenèse du VEB dans de nombreuses maladies ainsi que de la tumorigenèse associée au VEB. L’objectif de cet article d’expérience visualisé est de fournir une vue d’ensemble de l’isolement des particules virales EBV à partir de cellules de la lignée cellulaire P3HR1, suivi d’une quantification de la préparation virale. Les cellules P3HR1, isolées à l’origine d’un lymphome de Burkitt humain, peuvent produire un virus P3HR1, qui est une souche de type 2 du VEB. Le cycle lytique EBV peut être induit dans ces cellules P3HR1 par traitement avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), produisant des particules virales EBV.

En utilisant ce protocole pour l’isolement des particules EBV, les cellules P3HR1 sont cultivées pendant 5 jours à 37 °C et 5% de CO₂ dans un milieu RPMI-1640 complet contenant 35 ng / mL de PMA. Par la suite, le milieu de culture est centrifugé à une vitesse de 120 x g pendant 8 min pour granuler les cellules. Le surnageant contenant le virus est ensuite recueilli et filé à une vitesse de 16 000 x g pendant 90 minutes pour granuler les particules EBV. La pastille virale est ensuite remise en suspension dans un milieu RPMI-1640 complet. Ceci est suivi par l’extraction de l’ADN et la PCR quantitative en temps réel pour évaluer la concentration de particules EBV dans la préparation.

Introduction

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est le premier virus tumoral humain à avoir été isolé¹. Le VEB, officiellement appelé herpèsvirus humain 4 (HHV-4)², fait partie de la sous-famille des virus de l’herpès gamma de la famille des virus de l’herpès et est le prototype du genre Lymphocryptovirus. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le virus³. Dans la plupart des cas, l’infection initiale survient au cours des 3 premières années de vie et est asymptomatique, cependant, si l’infection survient plus tard au cours de l’adolescence, elle peut donner lieu à une maladie appelée mononucléose infectieuse⁴. Le VEB est capable d’infecter les lymphocytes B au repos, les incitant à devenir des lymphoblastes B prolifératifs dans lesquels le virus établit et maintient un état d’infection latente⁵. Le VEB peut se réactiver à tout moment et ainsi entraîner des infections récurrentes⁶.

Au cours des 50 dernières années, l’association entre certains virus et le développement de tumeurs malignes humaines est devenue de plus en plus évidente, et on estime aujourd’hui que 15% à 20% de tous les cancers humains sont liés à des infections virales⁷. Les virus de l’herpès, y compris EBV, sont parmi les exemples les mieux étudiés de ces types de virus tumoraux⁸. En fait, le VEB peut causer de nombreux types de tumeurs malignes humaines, comme le lymphome de Burkitt (LB), le lymphome hodgkinien (LH), le lymphome diffus à grandes cellules B et les maladies lymphoprolifératives chez les hôtes immunodéprimés ^9,10. Il a également été démontré que le VEB est associé au développement de maladies auto-immunes systémiques. Quelques exemples de ces maladies auto-immunes sont la polyarthrite rhumatoïde (PR), la polymyosite-dermatomyosite (PM-DM), le lupus érythémateux disséminé (LED), la maladie mixte du tissu conjonctif (MCTD) et le syndrome de Gougerot-Sjögren (SS)¹¹. Le VEB est également associé au développement d’une maladie inflammatoire de l’intestin (MII)¹².

Bon nombre de ces maladies peuvent être étudiées ou modélisées à l’aide de cultures cellulaires, de souris ou d’autres organismes infectés par le VEB. C’est pourquoi les particules EBV sont nécessaires pour infecter des cellules ou des organismes, que ce soit in vitro ou in vivo modèles^13,14,15,16, d’où la nécessité de développer une technique permettant d’isoler les particules virales à faible coût. Le protocole décrit ici fournit des lignes directrices pour un moyen facile d’isoler de manière fiable les particules EBV d’une lignée cellulaire relativement accessible et de quantifier les particules en utilisant la PCR en temps réel, qui est rentable et facilement disponible pour la plupart des laboratoires. Ceci est en comparaison avec plusieurs autres méthodes qui ont été décrites pour isoler le VEB de différentes lignées cellulaires^17,18,19,20.

P3HR-1 est une lignée cellulaire BL qui se développe en suspension et est infectée de manière latente par une souche EBV de type 2. Cette lignée cellulaire est productrice d’EBV et peut être induite à produire des particules virales. L’objectif de ce manuscrit est de présenter une méthode qui permet d’isoler les particules d’EBV de la lignée cellulaire P3HR-1, suivie d’une quantification du stock viral qui pourrait ensuite être utilisée pour des modèles expérimentaux de VEB in vitro et in vivo .

Protocol

NOTA : Le VEB devrait être considéré comme une matière potentiellement dangereuse pour la biologie et devrait donc être manipulé dans un cadre de confinement de niveau de biosécurité 2 ou supérieur. Une blouse de laboratoire ainsi que des gants doivent être portés. S’il y a un risque d’éclaboussure, une protection oculaire doit également être envisagée. La procédure suivante devrait être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique. 1. Compter les cellules P…

Representative Results

Le but de cette procédure est d’isoler les particules de VEB dans une suspension avec un titre viral connu, qui pourrait ensuite être utilisé pour modéliser l’infection par le VEB. Ainsi, il est de la plus haute importance d’utiliser des concentrations optimales des différents réactifs pour obtenir le rendement EBV le plus élevé de la procédure. Un essai d’optimisation a été effectué pour déterminer les concentrations de PMA et de DMSO qui donneraient le plus grand nombre …

Discussion

La production de particules EBV est nécessaire pour comprendre la biologie de ce virus ainsi que ses maladies associées. Ici, nous avons décrit la production de ces particules à partir de la lignée cellulaire P3HR-1. Cette lignée cellulaire n’est pas la seule lignée productrice d’EBV; en fait, des particules d’EBV ont également été isolées à partir de cellules B95-8^21,22 ainsi que de la lignée cellulaire Raji^18,19<sup c…

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121