通过高通量微流体压缩系统对多细胞生物进行机械刺激
Summary
本协议描述了微流体系统的设计，制造和表征，该系统能够以最少的用户干预对齐，固定和精确压缩数百个 黑腹果蝇 胚胎。该系统可实现高分辨率成像和样品回收，以进行刺激后分析，并且可以扩展以适应其他多细胞生物系统。
Abstract
在胚胎发生过程中，协调的细胞运动产生调节基因表达和活性的机械力。为了研究这一过程，已经使用抽吸或盖玻片压缩等工具来机械刺激整个胚胎。这些方法限制了实验设计，因为它们不精确，需要人工处理，并且只能同时处理几个胚胎。微流体系统在自动化此类实验任务的同时提高通量和精度方面具有巨大潜力。本文描述了一种微流体系统，用于精确压缩整个 黑腹果 蝇（果蝇）胚胎。该系统具有带有气动驱动可变形侧壁的微通道，可实现胚胎对齐、固定、压缩和刺激后收集。通过将这些微通道并行到七个通道中，可以同时将稳定或动态压缩模式应用于数百个 果蝇 胚胎。在玻璃盖玻片上制造该系统有助于使用高分辨率显微镜同时对样品进行机械刺激和成像。此外，利用生物相容性材料（如PDMS）以及流体流过系统的能力使该设备能够对介质依赖性样品进行长期实验。这种方法还消除了手动安装的需要，手动安装会对样品施加机械压力。此外，从微通道快速收集样品的能力使刺激后分析成为可能，包括需要大量样品的组学测定，这是使用传统机械刺激方法无法实现的。该系统的几何形状易于扩展到不同的生物系统，使许多领域能够从本文描述的功能特征中受益，包括高样品通量、机械刺激或固定以及自动比对。
Introduction
生命系统在其一生中不断经历并响应各种机械输入1.机械转导与许多疾病有关，包括发育障碍、肌肉和骨质流失以及通过直接或间接受机械环境影响的信号通路的神经病理学2。然而，机械敏感信号通路4中受机械刺激3调控的基因和蛋白质在很大程度上仍然未知5，阻碍了机械调节机制的阐明和与病理机械转导相关的疾病的分子靶点的鉴定6，7.将机械生物学研究投射到相关生理过程的一个限制因素是使用具有常规培养皿的单个细胞而不是完整的多细胞生物。模式生物，如黑腹果蝇（果蝇），对理解参与动物发育的基因、信号通路和蛋白质做出了巨大贡献8，9，10。然而，在机械生物学研究中使用果蝇和其他多细胞模式生物受到实验工具挑战的阻碍。用于准备、分类、成像或应用各种刺激的传统技术大多需要手动操作;这些方法非常耗时，需要专业知识，引入可变性，并限制实验设计和样本量11。最近的微技术进步是实现具有非常高通量和高度受控实验参数的新型生物测定的重要资源12，13，14。
本文介绍了一种增强型微流体装置的开发，该装置以单轴压缩的形式对准、固定和精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎15（图 1）。微流体系统与玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间对样品进行高分辨率共聚焦成像。微流体装置还能够在刺激后快速收集胚胎以进行组学测定（图2）。本文描述了该装置的设计考虑因素，以及使用软光刻和实验表征的制造。由于制造这种器件的硅晶圆模具需要在具有高纵横比（AR）沟槽（AR >5）的大面积上均匀涂覆厚光刻胶（厚度>200μm），因此该方法大大修改了传统的光刻模具制造方案。通过这种方式，该方法促进了光刻胶的处理、粘附、涂覆、图案化和开发。此外，还讨论了潜在的陷阱及其解决方案。最后，使用其他多细胞系统（如 果蝇 卵室和脑类器官16）证明了这种设计和制造策略的多功能性。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种微流体装置的开发，该装置可以自动对齐，固定并精确地将机械刺激应用于数百个完整的 果蝇 胚胎。微流体系统与薄玻璃盖玻片的集成允许在刺激期间用高分辨率共聚焦显微镜对胚胎进行成像。微流体装置还能够在刺激后立即收集胚胎以进行下游生物测定。详细描述了该器件的设计考虑因素、制造方法和特性。硅晶圆模具制造方案允许光刻胶具有高纵横比沟槽的均匀厚涂?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家科学基金会（CMMI-1946456）、空军科学研究办公室（FA9550-18-1-0262）和美国国立卫生研究院（R01AG06100501A1;R21AR08105201A1）。
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
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