التحفيز الميكانيكي للكائنات متعددة الخلايا من خلال نظام ضغط الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية
Summary
يصف البروتوكول الحالي تصميم وتصنيع وتوصيف نظام الموائع الدقيقة القادر على محاذاة وتجميد وضغط المئات من أجنة ذبابة الفاكهة الميلانية بدقة مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم. يتيح هذا النظام تصويرا عالي الدقة واستعادة العينات لتحليل ما بعد التحفيز ويمكن تحجيمه لاستيعاب الأنظمة البيولوجية الأخرى متعددة الخلايا.
Abstract
أثناء التطور الجنيني ، تولد حركة الخلية المنسقة قوى ميكانيكية تنظم التعبير الجيني ونشاطه. لدراسة هذه العملية ، تم استخدام أدوات مثل الشفط أو ضغط الانزلاق المغطى لتحفيز الأجنة الكاملة ميكانيكيا. تحد هذه الأساليب من التصميم التجريبي لأنها غير دقيقة ، وتتطلب معالجة يدوية ، ويمكنها معالجة بضعة أجنة فقط في وقت واحد. تتمتع أنظمة الموائع الدقيقة بإمكانات كبيرة لأتمتة مثل هذه المهام التجريبية مع زيادة الإنتاجية والدقة. توضح هذه المقالة نظام الموائع الدقيقة الذي تم تطويره لضغط أجنة ذبابة الفاكهة ( ذبابة الفاكهة ) بدقة. يتميز هذا النظام بقنوات دقيقة ذات جدران جانبية قابلة للتشوه تعمل بالهواء المضغوط ويتيح محاذاة الجنين ، والشلل ، والضغط ، وجمع ما بعد التحفيز. من خلال موازاة هذه القنوات الدقيقة في سبعة ممرات ، يمكن تطبيق أنماط ضغط ثابتة أو ديناميكية على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة في وقت واحد. إن تصنيع هذا النظام على غطاء زجاجي يسهل التحفيز الميكانيكي المتزامن وتصوير العينات باستخدام مجاهر عالية الدقة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المواد المتوافقة حيويا ، مثل PDMS ، والقدرة على تدفق السوائل عبر النظام يجعل هذا الجهاز قادرا على إجراء تجارب طويلة الأجل مع عينات تعتمد على الوسائط. يلغي هذا النهج أيضا متطلبات التركيب اليدوي الذي يضغط ميكانيكيا على العينات. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على جمع العينات بسرعة من القنوات الدقيقة تتيح تحليلات ما بعد التحفيز ، بما في ذلك فحوصات -omics التي تتطلب أعدادا كبيرة من العينات لا يمكن تحقيقها باستخدام أساليب التحفيز الميكانيكي التقليدية. هندسة هذا النظام قابلة للتطوير بسهولة لأنظمة بيولوجية مختلفة ، مما يتيح للعديد من المجالات الاستفادة من الميزات الوظيفية الموضحة هنا بما في ذلك إنتاجية العينة العالية ، والتحفيز الميكانيكي أو الشلل ، والمحاذاة الآلية.
Introduction
تشهد الأنظمة الحية باستمرار وتستجيب لمختلف المدخلات الميكانيكية طوال حياتها1. تم ربط النقل الميكانيكي بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات النمو ، وفقدان العضلات والعظام ، والأمراض العصبية من خلال مسارات الإشارات المتأثرة بشكل مباشر أو غير مباشر بالبيئة الميكانيكية2. ومع ذلك ، فإن الجينات والبروتينات التي يتم تنظيمها عن طريق التحفيز الميكانيكي3 في مسارات الإشارات الحساسة للميكانيكية4 لا تزال غير معروفة إلى حد كبير5 ، مما يمنع توضيح آليات التنظيم الميكانيكي وتحديد الأهداف الجزيئية للأمراض المرتبطة بالنقل الميكانيكي المرضي 6,7 . أحد العوامل المحددة في إسقاط دراسات البيولوجيا الميكانيكية على العمليات الفسيولوجية ذات الصلة هو استخدام الخلايا الفردية مع أطباق الاستزراع التقليدية بدلا من الكائنات الحية متعددة الخلايا السليمة. ساهمت الكائنات الحية النموذجية ، مثل ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) ، بشكل كبير في فهم الجينات ومسارات الإشارات والبروتينات المشاركة في تنمية الحيوان8،9،10. ومع ذلك ، فإن استخدام ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات النموذجية متعددة الخلايا في أبحاث البيولوجيا الميكانيكية قد أعيقت بسبب التحديات المتعلقة بالأدوات التجريبية. تتطلب التقنيات التقليدية لإعداد أو فرز أو تصوير أو تطبيق محفزات مختلفة معالجة يدوية في الغالب. تستغرق هذه الأساليب وقتا طويلا ، وتتطلب خبرة ، وإدخال التباين ، والحد من التصميم التجريبي وحجم العينة11. تعد التطورات التكنولوجية الدقيقة الحديثة موردا رائعا لتمكين المقايسات البيولوجية الجديدة ذات الإنتاجية العالية جدا والمعلمات التجريبية عالية التحكم12،13،14.
توضح هذه المقالة تطوير جهاز موائع دقيقة محسن لمحاذاة التحفيز الميكانيكي وشل حركته وتطبيقه بدقة في شكل ضغط أحادي المحور على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة 15 (الشكل 1). سمح تكامل نظام الموائع الدقيقة مع غطاء زجاجي بتصوير متحد البؤر عالي الدقة للعينات أثناء التحفيز. كما مكن جهاز الموائع الدقيقة من الجمع السريع للأجنة بعد التحفيز لتشغيل مقايسات أوميكس (الشكل 2). يتم وصف تفسيرات اعتبارات التصميم لهذا الجهاز ، بالإضافة إلى التصنيع باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة والتوصيف التجريبي ، هنا. نظرا لأن صنع قالب رقاقة السيليكون لمثل هذا الجهاز يتطلب طلاءا موحدا من مقاومة الضوء السميكة (سمك >200 ميكرومتر) على مساحات كبيرة ذات خنادق ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية (AR) (AR >5) ، فقد عدلت هذه الطريقة بشكل كبير بروتوكول تصنيع القوالب الحجرية الضوئية. بهذه الطريقة ، سهلت هذه الطريقة التعامل مع مقاومة الضوء والالتصاق والطلاء والنقش وتطويرها. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المزالق المحتملة وحلولها. أخيرا ، تم إثبات تنوع استراتيجية التصميم والتصنيع هذه باستخدام أنظمة أخرى متعددة الخلايا مثل غرف بيض ذبابة الفاكهة وعضويات الدماغ16.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف المقالة تطوير جهاز الموائع الدقيقة لمحاذاة التحفيز الميكانيكي تلقائيا وشل حركته وتطبيقه بدقة على مئات من أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة. سمح دمج نظام الموائع الدقيقة مع غطاء زجاجي رقيق بتصوير الأجنة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة أثناء التحفيز. كما مكن جهاز الموائع ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CMMI-1946456) ، ومكتب القوات الجوية للبحث العلمي (FA9550-18-1-0262) ، والمعهد الوطني للصحة (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
