Mekanostimulering af flercellede organismer gennem et mikrofluidisk kompressionssystem med høj kapacitet
Summary
Den nuværende protokol beskriver design, fabrikation og karakterisering af et mikrofluidisk system, der er i stand til at tilpasse, immobilisere og præcist komprimere hundredvis af Drosophila melanogaster embryoner med minimal brugerintervention. Dette system muliggør billeddannelse i høj opløsning og gendannelse af prøver til analyse efter stimulering og kan skaleres til at rumme andre flercellede biologiske systemer.
Abstract
Under embryogenese genererer koordineret cellebevægelse mekaniske kræfter, der regulerer genekspression og aktivitet. For at studere denne proces er værktøjer som aspiration eller coverslip-kompression blevet brugt til mekanisk at stimulere hele embryoner. Disse tilgange begrænser eksperimentelt design, da de er upræcise, kræver manuel håndtering og kun kan behandle et par embryoner samtidigt. Mikrofluidiske systemer har et stort potentiale for at automatisere sådanne eksperimentelle opgaver, samtidig med at gennemstrømningen og præcisionen øges. Denne artikel beskriver et mikrofluidisk system udviklet til præcist at komprimere hele Drosophila melanogaster (frugtflue) embryoner. Dette system har mikrokanaler med pneumatisk aktiverede deformerbare sidevægge og muliggør embryojustering, immobilisering, kompression og indsamling efter stimulering. Ved at parallelisere disse mikrokanaler i syv baner kan stabile eller dynamiske kompressionsmønstre anvendes på hundredvis af Drosophila-embryoner samtidigt. Fremstilling af dette system på en glasdæksel letter samtidig mekanisk stimulering og billeddannelse af prøver med højopløsningsmikroskoper. Desuden gør brugen af biokompatible materialer, som PDMS, og evnen til at strømme væske gennem systemet denne enhed i stand til langsigtede eksperimenter med medieafhængige prøver. Denne fremgangsmåde eliminerer også kravet om manuel montering, som mekanisk belaster prøverne. Desuden muliggør evnen til hurtigt at indsamle prøver fra mikrokanalerne poststimuleringsanalyser, herunder -omics-assays, der kræver store prøveantal, der er uopnåelige ved hjælp af traditionelle mekaniske stimuleringsmetoder. Geometrien i dette system er let skalerbar til forskellige biologiske systemer, hvilket gør det muligt for adskillige felter at drage fordel af de funktionelle funktioner, der er beskrevet heri, herunder høj prøvegennemstrømning, mekanisk stimulering eller immobilisering og automatiseret justering.
Introduction
Levende systemer oplever og reagerer konstant på forskellige mekaniske input gennem hele deres levetid1. Mekanotransduktion har været forbundet med mange sygdomme, herunder udviklingsforstyrrelser, muskel- og knogletab og neuropatologier gennem signalveje direkte eller indirekte påvirket af det mekaniske miljø2. De gener og proteiner, der reguleres ved mekanisk stimulering3 i de mekanosensitive signalveje4, forbliver imidlertid stort set ukendte5, hvilket forhindrer belysning af de mekaniske reguleringsmekanismer og identifikation af molekylære mål for sygdomme forbundet med patologisk mekanotransduktion 6,7 . En begrænsende faktor i at projicere mekanobiologistudier på de relaterede fysiologiske processer er at bruge individuelle celler med konventionelle kulturretter i stedet for intakte flercellede organismer. Modelorganismer, såsom Drosophila melanogaster (frugtflue), har bidraget meget til at forstå generne, signalvejene og proteinerne involveret i dyreudvikling 8,9,10. Ikke desto mindre er brugen af Drosophila og andre flercellede modelorganismer i mekanobiologiforskning blevet forhindret af udfordringer med eksperimentelle værktøjer. Konventionelle teknikker til forberedelse, sortering, billeddannelse eller anvendelse af forskellige stimuli kræver for det meste manuel manipulation; Disse tilgange er tidskrævende, kræver ekspertise, introducerer variabilitet og begrænser det eksperimentelle design og prøvestørrelse11. Nylige mikroteknologiske fremskridt er en stor ressource til at muliggøre nye biologiske assays med meget høj gennemstrømning og stærkt kontrollerede eksperimentelle parametre12,13,14.
Denne artikel beskriver udviklingen af en forbedret mikrofluidisk enhed til at justere, immobilisere og præcist anvende mekanisk stimulering i form af uniaxial kompression til hundredvis af hele Drosophila-embryoner 15 (figur 1). Integration af det mikrofluidiske system med en glasdæksel tillod konfokal billeddannelse i høj opløsning af prøverne under stimuleringen. Den mikrofluidiske enhed muliggjorde også hurtig indsamling af embryonerne efter stimuleringen til løbende -omics-assays (figur 2). Forklaringer af designovervejelserne for denne enhed samt fremstillingen ved hjælp af blød litografi og eksperimentel karakterisering er beskrevet heri. Da fremstilling af en siliciumskiveform af en sådan anordning kræver en ensartet belægning af tyk fotoresist (tykkelse >200 μm) over store områder med høje billedformat (AR) skyttegrave (AR >5), ændrede denne metode betydeligt den traditionelle fotolitografiske formfremstillingsprotokol. På denne måde lettede denne metode håndtering, vedhæftning, belægning, mønster og udvikling af fotoresisten. Derudover diskuteres potentielle faldgruber og deres løsninger. Endelig blev alsidigheden af denne design- og fabrikationsstrategi demonstreret ved hjælp af andre multicellulære systemer såsom Drosophila æggekamre og hjerneorganoider16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Artiklen beskriver udviklingen af en mikrofluidisk enhed til automatisk at justere, immobilisere og præcist anvende mekanisk stimulering på hundredvis af hele Drosophila-embryoner . Integrationen af det mikrofluidiske system med en tynd glasdæksel tillod billeddannelse af embryoner med højopløsnings konfokal mikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiske enhed muliggjorde også indsamling af embryonerne lige efter stimuleringen til løb nedstrøms biologiske assays. Designovervejelserne, fremstillingsme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (CMMI-1946456), Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) og National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
