Mécanostimulation d’organismes multicellulaires par un système de compression microfluidique à haut débit
Summary
Le présent protocole décrit la conception, la fabrication et la caractérisation d’un système microfluidique capable d’aligner, d’immobiliser et de comprimer avec précision des centaines d’embryons de Drosophila melanogaster avec une intervention minimale de l’utilisateur. Ce système permet l’imagerie haute résolution et la récupération d’échantillons pour l’analyse post-stimulation et peut être mis à l’échelle pour s’adapter à d’autres systèmes biologiques multicellulaires.
Abstract
Au cours de l’embryogenèse, le mouvement cellulaire coordonné génère des forces mécaniques qui régulent l’expression et l’activité des gènes. Pour étudier ce processus, des outils tels que l’aspiration ou la compression de feuillet de couverture ont été utilisés pour stimuler mécaniquement des embryons entiers. Ces approches limitent la conception expérimentale car elles sont imprécises, nécessitent une manipulation manuelle et ne peuvent traiter que quelques embryons simultanément. Les systèmes microfluidiques ont un grand potentiel pour automatiser de telles tâches expérimentales tout en augmentant le débit et la précision. Cet article décrit un système microfluidique développé pour comprimer avec précision les embryons entiers de Drosophila melanogaster (mouche des fruits). Ce système comporte des microcanaux avec des parois latérales déformables actionnées pneumatiquement et permet l’alignement de l’embryon, l’immobilisation, la compression et la collecte post-stimulation. En parallélisant ces microcanaux en sept voies, des schémas de compression stables ou dynamiques peuvent être appliqués à des centaines d’embryons de drosophile simultanément. La fabrication de ce système sur une lamelle de verre facilite la stimulation mécanique et l’imagerie simultanées d’échantillons avec des microscopes à haute résolution. De plus, l’utilisation de matériaux biocompatibles, tels que le PDMS, et la capacité de faire circuler le fluide dans le système rendent cet appareil capable d’expériences à long terme avec des échantillons dépendants du milieu. Cette approche élimine également la nécessité d’un montage manuel qui sollicite mécaniquement les échantillons. En outre, la possibilité de collecter rapidement des échantillons à partir des microcanaux permet des analyses post-stimulation, y compris des tests -omiques qui nécessitent un grand nombre d’échantillons inaccessible avec les approches de stimulation mécanique traditionnelles. La géométrie de ce système est facilement adaptable à différents systèmes biologiques, ce qui permet à de nombreux champs de bénéficier des caractéristiques fonctionnelles décrites ici, notamment un débit d’échantillon élevé, une stimulation mécanique ou une immobilisation et un alignement automatisé.
Introduction
Les systèmes vivants subissent et répondent constamment à diverses entrées mécaniques tout au long de leur vie1. La mécanotransduction a été liée à de nombreuses maladies, notamment les troubles du développement, la perte musculaire et osseuse et les neuropathologies par des voies de signalisation directement ou indirectement affectées par l’environnement mécanique2. Cependant, les gènes et protéines qui sont régulés par stimulation mécanique3 dans les voies de signalisation mécanosensibles4 restent largement inconnus5, empêchant l’élucidation des mécanismes de régulation mécanique et l’identification de cibles moléculaires pour les maladies associées à la mécanotransduction pathologique 6,7 . Un facteur limitant dans la projection des études de mécanobiologie sur les processus physiologiques connexes est l’utilisation de cellules individuelles avec des boîtes de culture conventionnelles au lieu d’organismes multicellulaires intacts. Les organismes modèles, tels que Drosophila melanogaster (mouche des fruits), ont grandement contribué à la compréhension des gènes, des voies de signalisation et des protéines impliquées dans le développement animal 8,9,10. Néanmoins, l’utilisation de la drosophile et d’autres organismes modèles multicellulaires dans la recherche en mécanobiologie a été entravée par des défis liés aux outils expérimentaux. Les techniques conventionnelles de préparation, de tri, d’imagerie ou d’application de divers stimuli nécessitent principalement une manipulation manuelle; Ces approches prennent beaucoup de temps, nécessitent une expertise, introduisent de la variabilité et limitent le plan expérimental et la taille de l’échantillon11. Les progrès microtechnologiques récents sont une excellente ressource pour permettre de nouveaux essais biologiques avec un débit très élevé et des paramètres expérimentaux hautement contrôlés12,13,14.
Cet article décrit le développement d’un dispositif microfluidique amélioré pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique sous forme de compression uniaxiale à des centaines d’embryons entiers de drosophile 15 (Figure 1). L’intégration du système microfluidique avec une lamelle de couverture en verre a permis une imagerie confocale haute résolution des échantillons pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis une collecte rapide des embryons après la stimulation pour l’exécution de tests -omiques (Figure 2). Des explications sur les considérations de conception de ce dispositif, ainsi que sur la fabrication par lithographie douce et caractérisation expérimentale, sont décrites ici. Étant donné que la fabrication d’un moule de plaquette de silicium d’un tel dispositif nécessite un revêtement uniforme de résine photosensible épaisse (épaisseur >200 μm) sur de grandes surfaces avec des tranchées à rapport d’aspect élevé (AR >5), cette méthode a considérablement modifié le protocole traditionnel de fabrication de moules photolithographiques. De cette façon, cette méthode a facilité la manipulation, l’adhérence, le revêtement, la structuration et le développement de la résine photosensible. De plus, les pièges potentiels et leurs solutions sont discutés. Enfin, la polyvalence de cette stratégie de conception et de fabrication a été démontrée à l’aide d’autres systèmes multicellulaires tels que les chambres à œufs de drosophile et les organoïdes cérébraux16.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’article décrit le développement d’un dispositif microfluidique pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique à des centaines d’embryons entiers de drosophile . L’intégration du système microfluidique avec une fine lamelle de verre a permis l’imagerie d’embryons avec une microscopie confocale à haute résolution pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis la collecte des embryons juste après la stimulation pour des tests biologi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (CMMI-1946456), l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) et le National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
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