Mechanostimulation mehrzelliger Organismen durch ein mikrofluidisches Kompressionssystem mit hohem Durchsatz
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Charakterisierung eines mikrofluidischen Systems, das in der Lage ist, Hunderte von Drosophila melanogaster-Embryonen mit minimalem Benutzereingriff auszurichten, zu immobilisieren und präzise zu komprimieren. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung und Rückgewinnung von Proben für die Analyse nach der Stimulation und kann skaliert werden, um andere mehrzellige biologische Systeme aufzunehmen.
Abstract
Während der Embryogenese erzeugt die koordinierte Zellbewegung mechanische Kräfte, die die Genexpression und -aktivität regulieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Werkzeuge wie Aspiration oder Deckglaskompression verwendet, um ganze Embryonen mechanisch zu stimulieren. Diese Ansätze schränken das experimentelle Design ein, da sie ungenau sind, manuelle Handhabung erfordern und nur ein paar Embryonen gleichzeitig verarbeiten können. Mikrofluidische Systeme haben großes Potenzial, solche experimentellen Aufgaben zu automatisieren und gleichzeitig den Durchsatz und die Präzision zu erhöhen. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches System, das entwickelt wurde, um ganze Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen) Embryonen präzise zu komprimieren. Dieses System verfügt über Mikrokanäle mit pneumatisch betätigten verformbaren Seitenwänden und ermöglicht die Ausrichtung des Embryos, die Immobilisierung, die Kompression und die Entnahme nach der Stimulation. Durch die Parallelisierung dieser Mikrokanäle in sieben Bahnen können stetige oder dynamische Kompressionsmuster auf Hunderte von Drosophila-Embryonen gleichzeitig angewendet werden. Die Herstellung dieses Systems auf einem Glasdeckglas ermöglicht die gleichzeitige mechanische Stimulation und Bildgebung von Proben mit hochauflösenden Mikroskopen. Darüber hinaus ermöglichen die Verwendung biokompatibler Materialien wie PDMS und die Fähigkeit, Flüssigkeit durch das System zu fließen, Langzeitexperimente mit medienabhängigen Proben. Dieser Ansatz eliminiert auch die Notwendigkeit einer manuellen Montage, die die Proben mechanisch belastet. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, schnell Proben aus den Mikrokanälen zu entnehmen, Post-Stimulationsanalysen, einschließlich -omics-Assays, die große Probenzahlen erfordern, die mit herkömmlichen mechanischen Stimulationsansätzen nicht erreichbar sind. Die Geometrie dieses Systems ist leicht auf verschiedene biologische Systeme skalierbar, so dass zahlreiche Felder von den hier beschriebenen funktionellen Merkmalen profitieren können, einschließlich eines hohen Probendurchsatzes, mechanischer Stimulation oder Immobilisierung und automatisierter Ausrichtung.
Introduction
Lebende Systeme erleben und reagieren während ihrer gesamten Lebensdauer ständig auf verschiedene mechanische Eingaben1. Mechanotransduktion wurde mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsstörungen, Muskel- und Knochenschwund und Neuropathologien durch Signalwege, die direkt oder indirekt von der mechanischen Umgebung beeinflusst werden2. Die Gene und Proteine, die durch mechanische Stimulation3 in den mechanosensitiven Signalwegen4 reguliert werden, bleiben jedoch weitgehend unbekannt5, was die Aufklärung der mechanischen Regulationsmechanismen und die Identifizierung molekularer Ziele für Erkrankungen im Zusammenhang mit pathologischer Mechanotransduktion verhindert 6,7 . Ein limitierender Faktor bei der Projektion mechanobiologischer Studien auf die damit verbundenen physiologischen Prozesse ist die Verwendung einzelner Zellen mit herkömmlichen Kulturschalen anstelle intakter mehrzelliger Organismen. Modellorganismen wie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben wesentlich zum Verständnis der Gene, Signalwege und Proteine beigetragen, die an der Tierentwicklung beteiligt sind 8,9,10. Dennoch wurde die Verwendung von Drosophila und anderen mehrzelligen Modellorganismen in der mechanologischen Forschung durch Herausforderungen mit experimentellen Werkzeugen behindert. Konventionelle Techniken zur Vorbereitung, Sortierung, Bildgebung oder Anwendung verschiedener Reize erfordern meist manuelle Manipulation; Diese Ansätze sind zeitaufwendig, erfordern Fachwissen, führen zu Variabilität und begrenzen das experimentelle Design und die Stichprobengröße11. Jüngste mikrotechnologische Fortschritte sind eine großartige Ressource, um neuartige biologische Assays mit sehr hohem Durchsatz und streng kontrollierten experimentellen Parameternzu ermöglichen 12,13,14.
Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung eines verbesserten mikrofluidischen Geräts zur Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen Anwendung mechanischer Stimulation in Form von uniaxialer Kompression auf Hunderte von ganzen Drosophila-Embryonen 15 (Abbildung 1). Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem Glasdeckglas ermöglichte eine hochauflösende konfokale Bildgebung der Proben während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch eine schnelle Entnahme der Embryonen nach der Stimulation für laufende -omics-Assays (Abbildung 2). Erläuterungen zu den Designüberlegungen dieser Vorrichtung sowie zur Herstellung unter Verwendung von Softlithographie und experimenteller Charakterisierung werden hierin beschrieben. Da die Herstellung einer Siliziumwaferform aus einer solchen Vorrichtung eine gleichmäßige Beschichtung von dickem Fotolack (Dicke >200 μm) über große Flächen mit Gräben mit hohem Aspektverhältnis (AR >5) erfordert, modifizierte diese Methode das traditionelle photolithografische Formherstellungsprotokoll erheblich. Auf diese Weise erleichterte dieses Verfahren die Handhabung, Haftung, Beschichtung, Strukturierung und Entwicklung des Fotolacks. Darüber hinaus werden mögliche Fallstricke und deren Lösungen diskutiert. Schließlich wurde die Vielseitigkeit dieser Design- und Herstellungsstrategie anhand anderer mehrzelliger Systeme wie Drosophila-Eikammern und Gehirnorganoiden demonstriert16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Artikel beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Geräts zur automatischen Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen mechanischen Stimulation von Hunderten von ganzen Drosophila-Embryonen . Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem dünnen Glasdeckglas ermöglichte die Bildgebung von Embryonen mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch die Entnahme der Embryonen direkt nach der Stimulation für nachgeschaltete biol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (CMMI-1946456), dem Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) und dem National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
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