מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.
Abstract
במהלך העובר, תנועת תאים מתואמת יוצרת כוחות מכניים המווסתים את ביטוי הגנים ופעילותם. כדי ללמוד את התהליך הזה, כלים כגון שאיפה או דחיסת כיסוי שימשו כדי לעורר באופן מכני עוברים שלמים. גישות אלה מגבילות את התכנון הניסויי מכיוון שהן אינן מדויקות, דורשות טיפול ידני ויכולות לעבד רק כמה עוברים בו זמנית. למערכות מיקרופלואידיות יש פוטנציאל גדול לאוטומציה של משימות ניסיוניות כאלה תוך הגדלת התפוקה והדיוק. מאמר זה מתאר מערכת מיקרופלואידית שפותחה כדי לדחוס במדויק עוברים שלמים של Drosophila melanogaster (זבוב הפירות). מערכת זו כוללת מיקרו-ערוצים עם דפנות מעוותות המופעלות באופן פניאומטי ומאפשרת יישור עוברים, אימוביליזציה, דחיסה ואיסוף לאחר גירוי. על ידי הקבלה של מיקרו-ערוצים אלה לשבעה נתיבים, ניתן ליישם דפוסי דחיסה יציבים או דינמיים על מאות עוברי דרוזופילה בו זמנית. ייצור מערכת זו על מכסה זכוכית מאפשר גירוי מכני בו זמנית והדמיה של דגימות עם מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, השימוש בחומרים תואמים ביולוגית, כמו PDMS, והיכולת להזרים נוזל דרך המערכת הופכים את המכשיר הזה לבעל יכולת ניסויים ארוכי טווח עם דגימות תלויות מדיה. גישה זו גם מבטלת את הדרישה להרכבה ידנית אשר מדגישה באופן מכני דגימות. יתר על כן, היכולת לאסוף במהירות דגימות מהמיקרו-ערוצים מאפשרת ניתוחים לאחר גירוי, כולל מבחני -omics הדורשים מספרי דגימות גדולים שאינם ניתנים להשגה באמצעות גישות גירוי מכניות מסורתיות. הגיאומטריה של מערכת זו ניתנת להרחבה בקלות למערכות ביולוגיות שונות, ומאפשרת לשדות רבים ליהנות מהתכונות הפונקציונליות המתוארות כאן, כולל תפוקת דגימה גבוהה, גירוי מכני או אימוביליזציה, ויישור אוטומטי.
Introduction
מערכות חיות חוות ומגיבות ללא הרף לתשומות מכניות שונות במהלך חייהן1. Mechanotransduction נקשר למחלות רבות, כולל הפרעות התפתחותיות, אובדן שרירים ועצמות, ונוירופתולוגיות באמצעות מסלולי איתות המושפעים ישירות או בעקיפין מהסביבה המכנית2. עם זאת, הגנים והחלבונים המווסתים על ידי גירוי מכני3 במסלולי האיתות המכנו-סנסיטיביים4 נותרים ברובם לא ידועים5, ומונעים את הבהרת מנגנוני הוויסות המכני וזיהוי מטרות מולקולריות למחלות הקשורות למכניוטרנסדוקציה פתולוגית 6,7 . אחד הגורמים המגבילים בהקרנת מחקרים מכניוביולוגיים על התהליכים הפיזיולוגיים הקשורים לכך הוא שימוש בתאים בודדים עם כלי תרבית קונבנציונליים במקום באורגניזמים רב-תאיים שלמים. אורגניזמים לדוגמה, כגון Drosophila melanogaster (זבוב הפירות), תרמו רבות להבנת הגנים, מסלולי האיתות והחלבונים המעורבים בהתפתחות בעלי חיים 8,9,10. אף על פי כן, השימוש בדרוזופילה ובאורגניזמי מודל רב-תאיים אחרים במחקר המכנוביולוגי הופרע על ידי אתגרים בכלים ניסיוניים. טכניקות קונבנציונליות להכנה, מיון, הדמיה או יישום גירויים שונים דורשות בעיקר מניפולציה ידנית; גישות אלה גוזלות זמן רב, דורשות מומחיות, מציגות שונות ומגבילות את תכנון הניסוי ואת גודל המדגם11. ההתקדמות המיקרוטכנולוגית האחרונה היא משאב נהדר המאפשר בדיקות ביולוגיות חדשניות עם תפוקה גבוהה מאוד ופרמטרים ניסיוניים מבוקרים מאוד12,13,14.
מאמר זה מתאר את הפיתוח של מכשיר מיקרופלואידי משופר ליישור, שיתוק ויישום מדויק של גירוי מכני בצורה של דחיסה חד-אקסיאלית למאות עוברי דרוזופילה שלמים 15 (איור 1). אינטגרציה של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית אפשרה הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של הדגימות במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי גם איפשר איסוף מהיר של העוברים לאחר הגירוי לבדיקות ריצה -omics (איור 2). הסברים על שיקולי העיצוב של מכשיר זה, כמו גם הייצור באמצעות ליתוגרפיה רכה ואפיון ניסיוני, מתוארים כאן. מכיוון שיצירת תבנית פרוסות סיליקון של מכשיר כזה דורשת ציפוי אחיד של פוטורססיסט עבה (עובי >200 מיקרומטר) על פני שטחים גדולים עם תעלות יחס גובה-רוחב גבוה (AR >5), שיטה זו שינתה במידה ניכרת את פרוטוקול ייצור התבנית הפוטוליתוגרפית המסורתי. בדרך זו, שיטה זו הקלה על הטיפול, ההדבקה, הציפוי, הדפוס והפיתוח של הפוטורסיסט. בנוסף, נדונים מלכודות פוטנציאליות ופתרונותיהן. לבסוף, הרבגוניות של אסטרטגיית תכנון וייצור זו הודגמה באמצעות מערכות רב-תאיות אחרות כגון תאי ביצים דרוזופילה ואורגנואידים מוחיים16.
Protocol
Representative Results
Discussion
המאמר מתאר את התפתחותו של מכשיר מיקרופלואידי ליישור, שיתוק והפעלה מדויקת של גירוי מכני על מאות עוברי דרוזופילה שלמים. השילוב של המערכת המיקרופלואידית עם כיסוי זכוכית דק איפשר הדמיה של עוברים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה במהלך הגירוי. המכשיר המיקרופלואידי איפשר גם את אי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (CMMI-1946456), משרד חיל האוויר למחקר מדעי (FA9550-18-1-0262), והמכון הלאומי לבריאות (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
