Mekanostimulering av flercellede organismer gjennom et mikrofluidisk kompresjonssystem med høy gjennomstrømning

Summary

Den nåværende protokollen beskriver design, fabrikasjon og karakterisering av et mikrofluidisk system som er i stand til å justere, immobilisere og nøyaktig komprimere hundrevis av Drosophila melanogasterembryoer med minimal brukerintervensjon. Dette systemet muliggjør høyoppløselig avbildning og gjenoppretting av prøver for poststimuleringsanalyse og kan skaleres for å imøtekomme andre flercellede biologiske systemer.

Abstract

Under embryogenese genererer koordinert cellebevegelse mekaniske krefter som regulerer genuttrykk og aktivitet. For å studere denne prosessen har verktøy som aspirasjon eller dekkslipkompresjon blitt brukt til å mekanisk stimulere hele embryoer. Disse tilnærmingene begrenser eksperimentell design da de er upresise, krever manuell håndtering og kan behandle bare et par embryoer samtidig. Mikrofluidiske systemer har stort potensial for å automatisere slike eksperimentelle oppgaver samtidig som gjennomstrømning og presisjon økes. Denne artikkelen beskriver et mikrofluidisk system utviklet for å nøyaktig komprimere hele Drosophila melanogaster (fruktflue) embryoer. Dette systemet har mikrokanaler med pneumatisk aktiverte deformerbare sidevegger og muliggjør embryojustering, immobilisering, kompresjon og innsamling etter stimulering. Ved å parallellisere disse mikrokanalene i syv baner, kan stabile eller dynamiske kompresjonsmønstre påføres hundrevis av Drosophila-embryoer samtidig. Fremstilling av dette systemet på et glassdeksel letter samtidig mekanisk stimulering og avbildning av prøver med høyoppløselige mikroskoper. Videre gjør bruken av biokompatible materialer, som PDMS, og evnen til å strømme væske gjennom systemet denne enheten i stand til langsiktige eksperimenter med medieavhengige prøver. Denne tilnærmingen eliminerer også kravet til manuell montering som mekanisk stresser prøver. Videre muliggjør muligheten til raskt å samle prøver fra mikrokanalene poststimuleringsanalyser, inkludert -omics-analyser som krever store prøvetall som er uoppnåelige ved hjelp av tradisjonelle mekaniske stimuleringsmetoder. Geometrien til dette systemet er lett skalerbar til forskjellige biologiske systemer, slik at mange felt kan dra nytte av de funksjonelle funksjonene som er beskrevet her, inkludert høy prøvegjennomstrømning, mekanisk stimulering eller immobilisering og automatisert justering.

Introduction

Levende systemer opplever og reagerer kontinuerlig på ulike mekaniske innganger gjennom hele levetiden¹. Mekanotransduksjon har vært knyttet til mange sykdommer, inkludert utviklingsforstyrrelser, muskel- og bentap og nevropatologier gjennom signalveier direkte eller indirekte påvirket av det mekaniske miljøet². Imidlertid forblir gener og proteiner som reguleres av mekanisk stimulering³ i de mekanosensitive signalveiene⁴ stort sett ukjente⁵, og forhindrer belysning av de mekaniske reguleringsmekanismene og identifisering av molekylære mål for sykdommer forbundet med patologisk mekanotransduksjon ^6,7 . En begrensende faktor i å projisere mekanobiologistudier på de relaterte fysiologiske prosessene er å bruke individuelle celler med konvensjonelle kulturretter i stedet for intakte flercellede organismer. Modellorganismer, som Drosophila melanogaster (bananflue), har bidratt sterkt til å forstå gener, signalveier og proteiner involvert i dyreutvikling 8,9,10. Likevel har bruk av Drosophila og andre flercellede modellorganismer i mekanobiologiforskning blitt hindret av utfordringer med eksperimentelle verktøy. Konvensjonelle teknikker for å forberede, sortere, avbildning eller anvende ulike stimuli krever for det meste manuell manipulasjon; Disse tilnærmingene er tidkrevende, krever ekspertise, introduserer variabilitet og begrenser eksperimentell design og utvalgsstørrelse¹¹. Nylige mikroteknologiske fremskritt er en stor ressurs for å muliggjøre nye biologiske analyser med svært høy gjennomstrømning og høyt kontrollerte eksperimentelle parametere^12,13,14.

Denne artikkelen beskriver utviklingen av en forbedret mikrofluidisk enhet for å justere, immobilisere og nøyaktig anvende mekanisk stimulering i form av uniaxial kompresjon til hundrevis av hele Drosophila-embryoer ¹⁵ (figur 1). Integrering av det mikrofluidiske systemet med et glassdeksel tillot høyoppløselig konfokal avbildning av prøvene under stimuleringen. Den mikrofluidiske enheten muliggjorde også rask innsamling av embryoene etter stimuleringen for å kjøre -omics-analyser (figur 2). Forklaringer av designhensynene til denne enheten, samt fabrikasjonen ved hjelp av myk litografi og eksperimentell karakterisering, er beskrevet her. Siden det å lage en silisiumskiveform av en slik anordning krever et jevnt belegg av tykk fotoresist (tykkelse >200 μm) over store områder med AR-grøfter (AR >5), endret denne metoden betydelig den tradisjonelle fotolitografiske formfabrikasjonsprotokollen. På denne måten lettet denne metoden håndtering, vedheft, belegg, mønster og utvikling av fotoresisten. I tillegg diskuteres potensielle fallgruver og deres løsninger. Til slutt ble allsidigheten til denne design- og fabrikasjonsstrategien demonstrert ved hjelp av andre flercellede systemer som Drosophila eggkamre og hjerneorganoider¹⁶.

Protocol

1. Fremstilling av silisiumskiveformen Rengjør silisiumskiven (se materialtabell) først med aceton og deretter med isopropylalkohol (IPA). Legg silisiumskiven på en 250 °C kokeplate i 30 minutter for dehydrering (figur 3A). Belegg silisiumskiven med heksametyldisilazan (HDMS) i en dampprimovn (se materialtabell) (prosesstemperatur: 150 °C, prosesstrykk: 2 Torr, prosesstid: 5 min, HDMS-volum: 5 μL) (<strong…

Representative Results

Det mikrofluidiske systemet er delt inn i to underrom adskilt av deformerbare PDMS-sidevegger. Det første rommet er væskesystemet der Drosophila-embryoer blir introdusert, automatisk justert, stilt opp og komprimert. Det andre rommet er et gassystem der gasstrykket på hver side av kompresjonskanalene styres via blindvei mikrokanaler for nøyaktig å kontrollere kompresjonskanalenes effektive bredde. Den mikrofluidiske enheten er forseglet med et glassglass nederst, noe som muliggjør høyoppløselig …

Discussion

Artikkelen beskriver utviklingen av en mikrofluidisk enhet for automatisk å justere, immobilisere og nøyaktig anvende mekanisk stimulering på hundrevis av hele Drosophila-embryoer . Integrasjonen av det mikrofluidiske systemet med et tynt glassdeksel tillot avbildning av embryoer med høyoppløselig konfokal mikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiske enheten gjorde det også mulig å samle embryoene rett etter stimuleringen for å kjøre nedstrøms biologiske analyser. Designhensynene, fabrikasjonsmet…

Materials

100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87