Summary

Механостимуляция многоклеточных организмов с помощью высокопроизводительной микрофлюидной компрессионной системы

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Настоящий протокол описывает проектирование, изготовление и характеристику микрофлюидной системы, способной выравнивать, обездвиживать и точно сжимать сотни эмбрионов Drosophila melanogaster с минимальным вмешательством пользователя. Эта система позволяет получать изображения с высоким разрешением и восстанавливать образцы для постстимуляционного анализа и может быть масштабирована для размещения других многоклеточных биологических систем.

Abstract

Во время эмбриогенеза скоординированное движение клеток генерирует механические силы, которые регулируют экспрессию и активность генов. Для изучения этого процесса были использованы такие инструменты, как аспирация или компрессия чехла, для механической стимуляции целых эмбрионов. Эти подходы ограничивают экспериментальное проектирование, поскольку они неточны, требуют ручного обращения и могут обрабатывать только пару эмбрионов одновременно. Микрофлюидные системы имеют большой потенциал для автоматизации таких экспериментальных задач при одновременном повышении пропускной способности и точности. В этой статье описывается микрофлюидная система, разработанная для точного сжатия целых эмбрионов Drosophila melanogaster (плодовой мухи). Эта система оснащена микроканалами с пневматически приводимыми деформируемыми боковыми стенками и обеспечивает выравнивание эмбриона, иммобилизацию, компрессию и сбор постстимуляции. Распараллеливая эти микроканалы в семь полос, устойчивые или динамические схемы сжатия могут быть применены к сотням эмбрионов дрозофилы одновременно. Изготовление этой системы на стеклянном крышке облегчает одновременную механическую стимуляцию и визуализацию образцов с помощью микроскопов высокого разрешения. Более того, использование биосовместимых материалов, таких как PDMS, и способность пропускать жидкость через систему делают это устройство способным к долгосрочным экспериментам с образцами, зависящими от среды. Такой подход также устраняет необходимость ручного монтажа, который механически напрягает образцы. Кроме того, возможность быстрого сбора образцов с микроканалов позволяет проводить постстимуляционный анализ, включая омические анализы, которые требуют больших количеств образцов, недостижимых с использованием традиционных подходов механической стимуляции. Геометрия этой системы легко масштабируется для различных биологических систем, что позволяет многочисленным полям извлекать выгоду из функциональных особенностей, описанных в настоящем описании, включая высокую пропускную способность образца, механическую стимуляцию или иммобилизацию и автоматическое выравнивание.

Introduction

Живые системы постоянно испытывают и реагируют на различные механические входы на протяжении всей своей жизни1. Механотрансдукция была связана со многими заболеваниями, включая нарушения развития, потерю мышечной и костной массы, а также невропатологии через сигнальные пути, прямо или косвенно затронутые механической средой2. Однако гены и белки, которые регулируются механической стимуляцией3 в механочувствительных сигнальных путях4, остаются в значительной степени неизвестными5, препятствуя выяснению механизмов механической регуляции и идентификации молекулярных мишеней для заболеваний, связанных с патологической механотрансдукцией 6,7 . Одним из ограничивающих факторов в проецировании механобиологических исследований на связанные физиологические процессы является использование отдельных клеток с обычными культуральными блюдами вместо интактных многоклеточных организмов. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster (плодовая муха), внесли большой вклад в понимание генов, сигнальных путей и белков, участвующих в развитии животных 8,9,10. Тем не менее, использование дрозофилы и других многоклеточных модельных организмов в механобиологических исследованиях было затруднено проблемами с экспериментальными инструментами. Традиционные методы подготовки, сортировки, визуализации или применения различных стимулов требуют в основном ручных манипуляций; эти подходы отнимают много времени, требуют специальных знаний, вносят вариативность и ограничивают экспериментальный дизайн и размер выборки11. Последние достижения в области микротехнологий являются отличным ресурсом для создания новых биологических анализов с очень высокой пропускной способностью и строго контролируемыми экспериментальными параметрами 12,13,14.

В этой статье описывается разработка усовершенствованного микрофлюидного устройства для выравнивания, иммобилизации и точного применения механической стимуляции в виде одноосного сжатия к сотням целых эмбрионов дрозофилы 15 (рисунок 1). Интеграция микрофлюидной системы со стеклянным чехлом позволила получить конфокальную визуализацию образцов с высоким разрешением во время стимуляции. Микрофлюидное устройство также позволило быстро собирать эмбрионы после стимуляции для проведения анализов -омики (рисунок 2). Объяснения конструктивных соображений этого устройства, а также изготовления с использованием мягкой литографии и экспериментальной характеристики описаны в настоящем документе. Поскольку изготовление силиконовой пластинчатой формы такого устройства требует равномерного покрытия толстого фоторезиста (толщина >200 мкм) на больших площадях с высоким соотношением сторон (AR) траншей (AR >5), этот метод значительно изменил традиционный протокол изготовления фотолитографической формы. Таким образом, этот метод облегчил обработку, адгезию, покрытие, рисунок и развитие фоторезиста. Кроме того, обсуждаются потенциальные подводные камни и их решения. Наконец, универсальность этой стратегии проектирования и изготовления была продемонстрирована с использованием других многоклеточных систем, таких как камеры яйцеклеток дрозофилы и органоиды мозга16.

Protocol

1. Подготовка силиконовой пластинчатой формы Очистите кремниевую пластину (см. Таблицу материалов) сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом (IPA). Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 250 °C в течение 30 минут для обезвоживания (<strong cl…

Representative Results

Микрофлюидная система разделена на два подотсека, разделенных деформируемыми боковыми стенками PDMS. Первый отсек представляет собой жидкую систему, в которую вводятся эмбрионы дрозофилы , автоматически выравниваются, выстраиваются и сжимаются. Второй отсек представляет собой га?…

Discussion

В статье описывается разработка микрофлюидного устройства для автоматического выравнивания, обездвиживания и точного применения механической стимуляции к сотням целых эмбрионов дрозофилы . Интеграция микрофлюидной системы с тонким стеклянным покровом позволила во время стиму…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CMMI-1946456), Управлением научных исследований ВВС (FA9550-18-1-0262) и Национальным институтом здравоохранения (R01AG06100501A1; Р21АР08105201А1).

Materials

100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes Fisher 14-955-111B Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer University Wafer 452
Biopsy punches Ted Pella 15110
Bleach Not brand specific
Blunt needle set CML Supply 901
Contact Mask Aligner Quintel Q4000 MA
Cutting mat Dahle Vantage 10670 size: 24" x 36"
Developer Kayaku Advance Materials SU-8 2000
Direct Write Lithographer Heidelberg MLA100
Dissecting microscope Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish Fisher FB0875713A
Glass slide Warner Instruments 64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven Yes Engineering YES-3TA
NaCl Not brand specific
Oven Labnet I5110A
Paintbrush Not brand specific
PDMS Dow Corning Sylgard 184
Photoresist MicroChem SU-8 2100
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Portable pressure source hygger Quietest HGD946
Pressure gauge Cole-Parmer EW-68950-25
Spin Coater Laurell WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) Sigma-Aldrich 448931-10G
Triton-X 100 Fisher AAA16046AP
Tubing Saint-Gobain 02-587-1A
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05
Vacuum Pump Cole-Parmer EW-07164-87

Riferimenti

  1. Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
  2. Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
  3. Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
  4. Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
  5. Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
  6. Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
  7. Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
  8. Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  9. Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
  10. Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
  11. Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
  12. Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
  13. Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
  14. Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
  15. Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
  16. Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
  17. Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
  18. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
  19. Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
  20. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
  21. Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
  22. Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
check_url/it/64281?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Sönmez, U. M., Frey, N., Minden, J. S., LeDuc, P. R. Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System. J. Vis. Exp. (190), e64281, doi:10.3791/64281 (2022).

View Video