Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento
Summary
El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.
Abstract
Durante la embriogénesis, el movimiento celular coordinado genera fuerzas mecánicas que regulan la expresión y la actividad génica. Para estudiar este proceso, se han utilizado herramientas como la aspiración o la compresión de cubreobjetos para estimular mecánicamente embriones enteros. Estos enfoques limitan el diseño experimental, ya que son imprecisos, requieren manipulación manual y pueden procesar solo un par de embriones simultáneamente. Los sistemas microfluídicos tienen un gran potencial para automatizar tales tareas experimentales al tiempo que aumentan el rendimiento y la precisión. Este artículo describe un sistema microfluídico desarrollado para comprimir con precisión embriones enteros de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Este sistema cuenta con microcanales con paredes laterales deformables accionadas neumáticamente y permite la alineación del embrión, la inmovilización, la compresión y la recolección posterior a la estimulación. Al paralelizar estos microcanales en siete carriles, se pueden aplicar patrones de compresión constantes o dinámicos a cientos de embriones de Drosophila simultáneamente. La fabricación de este sistema en un cubreobjetos de vidrio facilita la estimulación mecánica simultánea y la obtención de imágenes de muestras con microscopios de alta resolución. Además, la utilización de materiales biocompatibles, como PDMS, y la capacidad de fluir fluido a través del sistema hacen que este dispositivo sea capaz de experimentos a largo plazo con muestras dependientes de medios. Este enfoque también elimina el requisito de montaje manual que estresa mecánicamente las muestras. Además, la capacidad de recoger rápidamente muestras de los microcanales permite análisis posteriores a la estimulación, incluidos los ensayos -ómicos que requieren grandes números de muestra inalcanzables utilizando los enfoques tradicionales de estimulación mecánica. La geometría de este sistema es fácilmente escalable a diferentes sistemas biológicos, lo que permite que numerosos campos se beneficien de las características funcionales descritas en este documento, incluido el alto rendimiento de la muestra, la estimulación mecánica o la inmovilización y la alineación automatizada.
Introduction
Los sistemas vivos experimentan y responden constantemente a diversas entradas mecánicas a lo largo de su vida útil1. La mecanotransducción se ha relacionado con muchas enfermedades, incluyendo trastornos del desarrollo, pérdida muscular y ósea, y neuropatologías a través de vías de señalización directa o indirectamente afectadas por el ambiente mecánico2. Sin embargo, los genes y proteínas que están regulados por la estimulación mecánica3 en las vías de señalización mecanosensibles4 permanecen en gran parte desconocidos5, impidiendo la elucidación de los mecanismos de regulación mecánica y la identificación de dianas moleculares para enfermedades asociadas a la mecanotransducción patológica 6,7 . Un factor limitante en la proyección de estudios mecanobiológicos sobre los procesos fisiológicos relacionados es el uso de células individuales con placas de cultivo convencionales en lugar de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), han contribuido en gran medida a la comprensión de los genes, las vías de señalización y las proteínas involucradas en el desarrollo animal 8,9,10. Sin embargo, el uso de Drosophila y otros organismos modelo multicelulares en la investigación mecanobiológica se ha visto obstaculizado por desafíos con herramientas experimentales. Las técnicas convencionales para preparar, clasificar, obtener imágenes o aplicar diversos estímulos requieren principalmente manipulación manual; Estos enfoques consumen mucho tiempo, requieren experiencia, introducen variabilidad y limitan el diseño experimental y el tamaño de la muestra11. Los recientes avances microtecnológicos son un gran recurso para permitir nuevos ensayos biológicos con un rendimiento muy alto y parámetros experimentales altamente controlados12,13,14.
Este artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico mejorado para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica en forma de compresión uniaxial a cientos de embriones enteros de Drosophila 15 (Figura 1). La integración del sistema microfluídico con un cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes confocales de alta resolución de las muestras durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección rápida de los embriones después de la estimulación para ejecutar ensayos -ómicos (Figura 2). Las explicaciones de las consideraciones de diseño de este dispositivo, así como la fabricación utilizando litografía blanda y caracterización experimental, se describen aquí. Dado que la fabricación de un molde de oblea de silicio de un dispositivo de este tipo requiere un recubrimiento uniforme de fotorresistencia gruesa (espesor >200 μm) en grandes áreas con zanjas de alta relación de aspecto (AR) (AR >5), este método modificó considerablemente el protocolo tradicional de fabricación de moldes fotolitográficos. De esta manera, este método facilitó el manejo, adhesión, recubrimiento, modelado y desarrollo de la fotorresistencia. Además, se discuten los peligros potenciales y sus soluciones. Por último, la versatilidad de esta estrategia de diseño y fabricación se demostró utilizando otros sistemas multicelulares como las cámaras de huevos de Drosophila y los organoides cerebrales16.
Protocol
Representative Results
Discussion
El artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica automáticamente a cientos de embriones completos de Drosophila . La integración del sistema microfluídico con un delgado cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes de embriones con microscopía confocal de alta resolución durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección de los embriones justo después de la estimulaci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1946456), la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (FA9550-18-1-0262) y el Instituto Nacional de Salud (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
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