Mekanostimulering av flercelliga organismer genom ett mikrofluidiskt kompressionssystem med hög genomströmning
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver design, tillverkning och karakterisering av ett mikrofluidiskt system som kan anpassa, immobilisera och exakt komprimera hundratals Drosophila melanogaster-embryon med minimal användarintervention. Detta system möjliggör högupplöst avbildning och återvinning av prover för analys efter stimulering och kan skalas för att rymma andra multicellulära biologiska system.
Abstract
Under embryogenesen genererar samordnad cellrörelse mekaniska krafter som reglerar genuttryck och aktivitet. För att studera denna process har verktyg som aspiration eller coverslip-kompression använts för att mekaniskt stimulera hela embryon. Dessa tillvägagångssätt begränsar experimentell design eftersom de är oprecisa, kräver manuell hantering och bara kan bearbeta ett par embryon samtidigt. Mikrofluidiska system har stor potential för att automatisera sådana experimentella uppgifter samtidigt som de ökar genomströmningen och precisionen. Denna artikel beskriver ett mikrofluidiskt system utvecklat för att exakt komprimera hela Drosophila melanogaster (fruktfluga ) embryon. Detta system har mikrokanaler med pneumatiskt manövrerade deformerbara sidoväggar och möjliggör embryoinriktning, immobilisering, kompression och insamling efter stimulering. Genom att parallellisera dessa mikrokanaler till sju banor kan stadiga eller dynamiska kompressionsmönster appliceras på hundratals Drosophila-embryon samtidigt. Att tillverka detta system på en glasöverdragare underlättar samtidig mekanisk stimulering och avbildning av prover med högupplösta mikroskop. Dessutom gör användningen av biokompatibla material, som PDMS, och förmågan att strömma vätska genom systemet denna enhet kapabel till långsiktiga experiment med medieberoende prover. Detta tillvägagångssätt eliminerar också kravet på manuell montering som mekaniskt belastar prover. Dessutom möjliggör förmågan att snabbt samla in prover från mikrokanalerna analyser efter stimulering, inklusive -omics-analyser som kräver stora provantal som inte kan uppnås med traditionella mekaniska stimuleringsmetoder. Geometrin i detta system är lätt skalbar till olika biologiska system, vilket gör det möjligt för många fält att dra nytta av de funktionella funktioner som beskrivs häri, inklusive hög provgenomströmning, mekanisk stimulering eller immobilisering och automatiserad inriktning.
Introduction
Levande system upplever och svarar ständigt på olika mekaniska ingångar under hela sin livstid1. Mekanotransduktion har kopplats till många sjukdomar, inklusive utvecklingsstörningar, muskel- och benförlust och neuropatologier genom signalvägar som direkt eller indirekt påverkas av den mekaniska miljön2. De gener och proteiner som regleras av mekanisk stimulering3 i de mekanokänsliga signalvägarna4 förblir emellertid i stort sett okända5, vilket förhindrar belysning av de mekaniska regleringsmekanismerna och identifiering av molekylära mål för sjukdomar associerade med patologisk mekanotransduktion 6,7 . En begränsande faktor för att projicera mekanobiologistudier på de relaterade fysiologiska processerna är att använda enskilda celler med konventionella odlingsskålar istället för intakta flercelliga organismer. Modellorganismer, såsom Drosophila melanogaster (bananfluga), har bidragit starkt till att förstå gener, signalvägar och proteiner som är involverade i djurutveckling 8,9,10. Ändå har användningen av Drosophila och andra flercelliga modellorganismer i mekanobiologisk forskning hindrats av utmaningar med experimentella verktyg. Konventionella tekniker för att förbereda, sortera, avbilda eller tillämpa olika stimuli kräver mestadels manuell manipulation; Dessa metoder är tidskrävande, kräver expertis, introducerar variabilitet och begränsar experimentell design och provstorlek11. De senaste mikrotekniska framstegen är en stor resurs för att möjliggöra nya biologiska analyser med mycket hög genomströmning och mycket kontrollerade experimentella parametrar12,13,14.
Denna artikel beskriver utvecklingen av en förbättrad mikrofluidisk anordning för att justera, immobilisera och exakt tillämpa mekanisk stimulering i form av enaxlig kompression på hundratals hela Drosophila-embryon 15 (Figur 1). Integrering av det mikrofluidiska systemet med en glasbeläggning möjliggjorde högupplöst konfokal avbildning av proverna under stimuleringen. Den mikrofluidiska anordningen möjliggjorde också snabb insamling av embryona efter stimuleringen för löpande -omics-analyser (figur 2). Förklaringar av designövervägandena för denna enhet, liksom tillverkningen med mjuk litografi och experimentell karakterisering, beskrivs häri. Eftersom tillverkning av en kiselskivform av en sådan anordning kräver en enhetlig beläggning av tjock fotoresist (tjocklek >200 μm) över stora områden med höga bildförhållande (AR) diken (AR >5), modifierade denna metod avsevärt det traditionella fotolitografiska formtillverkningsprotokollet. På detta sätt underlättade denna metod hantering, vidhäftning, beläggning, mönstring och utveckling av fotoresisten. Dessutom diskuteras potentiella fallgropar och deras lösningar. Slutligen demonstrerades mångsidigheten i denna design- och tillverkningsstrategi med hjälp av andra flercelliga system som Drosophila äggkammare och hjärnorganoider16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Artikeln beskriver utvecklingen av en mikrofluidisk anordning för att automatiskt justera, immobilisera och exakt tillämpa mekanisk stimulering på hundratals hela Drosophila-embryon . Integrationen av det mikrofluidiska systemet med en tunn glasbeläggning möjliggjorde avbildning av embryon med högupplöst konfokalmikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiska anordningen möjliggjorde också insamling av embryona direkt efter stimuleringen för att köra nedströms biologiska analyser. Designöverväga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (CMMI-1946456), Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) och National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Riferimenti
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
