Summary

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.

Abstract

Embriyogenez sırasında, koordineli hücre hareketi, gen ekspresyonunu ve aktivitesini düzenleyen mekanik kuvvetler üretir. Bu süreci incelemek için, tüm embriyoları mekanik olarak uyarmak için aspirasyon veya örtü slip sıkıştırma gibi araçlar kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, kesin olmadıkları, manuel kullanım gerektirdikleri ve aynı anda sadece birkaç embriyoyu işleyebildikleri için deneysel tasarımı sınırlar. Mikroakışkan sistemler, verimi ve hassasiyeti artırırken bu tür deneysel görevleri otomatikleştirmek için büyük potansiyele sahiptir. Bu makalede, tüm Drosophila melanogaster (meyve sineği) embriyolarını hassas bir şekilde sıkıştırmak için geliştirilen mikroakışkan bir sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, pnömatik olarak çalıştırılan deforme edilebilir yan duvarlara sahip mikro kanallara sahiptir ve embriyo hizalaması, immobilizasyon, sıkıştırma ve stimülasyon sonrası toplanmasını sağlar. Bu mikro kanalları yedi şeride paralel hale getirerek, aynı anda yüzlerce Drosophila embriyosuna sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulanabilir. Bu sistemin bir cam kapak parçası üzerinde imal edilmesi, numunelerin yüksek çözünürlüklü mikroskoplarla eşzamanlı mekanik stimülasyonunu ve görüntülenmesini kolaylaştırır. Dahası, PDMS gibi biyouyumlu malzemelerin kullanımı ve sistemden sıvı akıtma yeteneği, bu cihazı medyaya bağımlı numunelerle uzun süreli deneyler yapabilmektedir. Bu yaklaşım aynı zamanda numuneleri mekanik olarak geren manuel montaj gereksinimini de ortadan kaldırır. Ayrıca, mikrokanallardan hızlı bir şekilde numune toplama yeteneği, geleneksel mekanik stimülasyon yaklaşımları kullanılarak elde edilemeyen büyük örneklem sayıları gerektiren -omik testler de dahil olmak üzere stimülasyon sonrası analizlere olanak tanır. Bu sistemin geometrisi, farklı biyolojik sistemlere kolayca ölçeklenebilir ve çok sayıda alanın, yüksek numune verimi, mekanik stimülasyon veya immobilizasyon ve otomatik hizalama dahil olmak üzere burada açıklanan işlevsel özelliklerden yararlanmasını sağlar.

Introduction

Canlı sistemler, yaşamları boyunca çeşitli mekanik girdileri sürekli olarak deneyimlemekte ve bunlara yanıt vermektedir1. Mekanotransdüksiyon, gelişimsel bozukluklar, kas ve kemik kaybı ve mekanik ortamdan doğrudan veya dolaylı olarak etkilenen sinyal yolları yoluyla nöropatolojiler dahil olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir2. Bununla birlikte, mekanosensitif sinyal yolakları4’te mekanik stimülasyon3 ile düzenlenen genler ve proteinler büyük ölçüde bilinmemektedir5, mekanik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasını ve patolojik mekanotransdüksiyonla ilişkili hastalıklar için moleküler hedeflerin belirlenmesini engellemektedir 6,7 . Mekanobiyoloji çalışmalarının ilgili fizyolojik süreçlere yansıtılmasında sınırlayıcı bir faktör, bozulmamış çok hücreli organizmalar yerine geleneksel kültür çanaklarına sahip bireysel hücrelerin kullanılmasıdır. Drosophila melanogaster (meyve sineği) gibi model organizmalar, hayvan gelişiminde rol oynayan genlerin, sinyal yollarının ve proteinlerin anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur 8,9,10. Bununla birlikte, mekanobiyoloji araştırmalarında Drosophila ve diğer çok hücreli model organizmaların kullanılması, deneysel araçlarla ilgili zorluklarla engellenmiştir. Çeşitli uyaranları hazırlamak, sıralamak, görüntülemek veya uygulamak için kullanılan geleneksel teknikler çoğunlukla manuel manipülasyon gerektirir; Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır, uzmanlık gerektirir, değişkenlik getirir ve deneysel tasarımı ve örneklem büyüklüğünü sınırlar11. Son mikroteknolojik gelişmeler, çok yüksek verim ve yüksek kontrollü deneysel parametrelere sahip yeni biyolojik tahlillerin etkinleştirilmesi için harika bir kaynaktır12,13,14.

Bu makalede, yüzlerce Drosophila embriyosuna tek eksenli sıkıştırma şeklinde mekanik stimülasyonu hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için geliştirilmiş bir mikroakışkan cihazın geliştirilmesi anlatılmaktadır15 (Şekil 1). Mikroakışkan sistemin bir cam kapak kayışı ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında numunelerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülenmesini sağladı. Mikroakışkan cihaz ayrıca -omik tahlillerin çalıştırılması için stimülasyondan sonra embriyoların hızlı bir şekilde toplanmasını sağladı (Şekil 2). Bu cihazın tasarım hususlarının yanı sıra yumuşak litografi ve deneysel karakterizasyon kullanılarak yapılan imalatın açıklamaları burada açıklanmaktadır. Böyle bir cihazın silikon gofret kalıbını yapmak, yüksek en-boy oranlı (AR) hendeklere (AR >5) sahip geniş alanlar üzerinde kalın fotodirencin (kalınlık >200 μm) düzgün bir kaplamasını gerektirdiğinden, bu yöntem geleneksel fotolitografik kalıp imalat protokolünü önemli ölçüde değiştirdi. Bu şekilde, bu yöntem fotodirencin taşınmasını, yapışmasını, kaplanmasını, desenlenmesini ve geliştirilmesini kolaylaştırdı. Ek olarak, potansiyel tuzaklar ve çözümleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu tasarım ve üretim stratejisinin çok yönlülüğü, Drosophila yumurta odaları ve beyin organoidleri16 gibi diğer çok hücreli sistemler kullanılarak gösterilmiştir.

Protocol

1. Silikon gofret kalıbının hazırlanması Silikon gofreti (bakınız Malzeme Tablosu) önce asetonla, sonra izopropil alkolle (IPA) temizleyin. Silikon gofreti, dehidrasyon fırını için 30 dakika boyunca 250 °C’lik bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 3A). Silikon gofreti buhar asal fırında hekzametildiilazan (HDMS) ile kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu) (proses sıcaklığı: 150 °C, proses basınc?…

Representative Results

Mikroakışkan sistem, deforme olabilen PDMS yan duvarları ile ayrılmış iki alt bölmeye ayrılmıştır. İlk bölme, Drosophila embriyolarının tanıtıldığı, otomatik olarak hizalandığı, sıralandığı ve sıkıştırıldığı sıvı sistemdir. İkinci bölme, sıkıştırma kanallarının her iki tarafındaki gaz basıncının, sıkıştırma kanallarının etkin genişliğini hassas bir şekilde kontrol etmek için çıkmaz mikro kanallar aracılığıyla kontrol edildiği bir gaz sist…

Discussion

Makale, yüzlerce Drosophila embriyosuna mekanik stimülasyonu otomatik olarak hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için mikroakışkan bir cihazın geliştirilmesini açıklamaktadır. Mikroakışkan sistemin ince bir cam kapak kayması ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında embriyoların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini sağlamıştır. Mikroakışkan cihaz ayrıca, aşağı akış biyolojik tahlillerinin çalıştırılması için stim…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1946456), Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (FA9550-18-1-0262) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

Materials

100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes Fisher 14-955-111B Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer University Wafer 452
Biopsy punches Ted Pella 15110
Bleach Not brand specific
Blunt needle set CML Supply 901
Contact Mask Aligner Quintel Q4000 MA
Cutting mat Dahle Vantage 10670 size: 24" x 36"
Developer Kayaku Advance Materials SU-8 2000
Direct Write Lithographer Heidelberg MLA100
Dissecting microscope Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish Fisher FB0875713A
Glass slide Warner Instruments 64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven Yes Engineering YES-3TA
NaCl Not brand specific
Oven Labnet I5110A
Paintbrush Not brand specific
PDMS Dow Corning Sylgard 184
Photoresist MicroChem SU-8 2100
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Portable pressure source hygger Quietest HGD946
Pressure gauge Cole-Parmer EW-68950-25
Spin Coater Laurell WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) Sigma-Aldrich 448931-10G
Triton-X 100 Fisher AAA16046AP
Tubing Saint-Gobain 02-587-1A
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05
Vacuum Pump Cole-Parmer EW-07164-87

Riferimenti

  1. Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
  2. Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
  3. Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
  4. Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
  5. Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
  6. Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
  7. Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
  8. Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  9. Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
  10. Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
  11. Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
  12. Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
  13. Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
  14. Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
  15. Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
  16. Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
  17. Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
  18. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
  19. Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
  20. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
  21. Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
  22. Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
check_url/it/64281?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Sönmez, U. M., Frey, N., Minden, J. S., LeDuc, P. R. Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System. J. Vis. Exp. (190), e64281, doi:10.3791/64281 (2022).

View Video