Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.
Embriyogenez sırasında, koordineli hücre hareketi, gen ekspresyonunu ve aktivitesini düzenleyen mekanik kuvvetler üretir. Bu süreci incelemek için, tüm embriyoları mekanik olarak uyarmak için aspirasyon veya örtü slip sıkıştırma gibi araçlar kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, kesin olmadıkları, manuel kullanım gerektirdikleri ve aynı anda sadece birkaç embriyoyu işleyebildikleri için deneysel tasarımı sınırlar. Mikroakışkan sistemler, verimi ve hassasiyeti artırırken bu tür deneysel görevleri otomatikleştirmek için büyük potansiyele sahiptir. Bu makalede, tüm Drosophila melanogaster (meyve sineği) embriyolarını hassas bir şekilde sıkıştırmak için geliştirilen mikroakışkan bir sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, pnömatik olarak çalıştırılan deforme edilebilir yan duvarlara sahip mikro kanallara sahiptir ve embriyo hizalaması, immobilizasyon, sıkıştırma ve stimülasyon sonrası toplanmasını sağlar. Bu mikro kanalları yedi şeride paralel hale getirerek, aynı anda yüzlerce Drosophila embriyosuna sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulanabilir. Bu sistemin bir cam kapak parçası üzerinde imal edilmesi, numunelerin yüksek çözünürlüklü mikroskoplarla eşzamanlı mekanik stimülasyonunu ve görüntülenmesini kolaylaştırır. Dahası, PDMS gibi biyouyumlu malzemelerin kullanımı ve sistemden sıvı akıtma yeteneği, bu cihazı medyaya bağımlı numunelerle uzun süreli deneyler yapabilmektedir. Bu yaklaşım aynı zamanda numuneleri mekanik olarak geren manuel montaj gereksinimini de ortadan kaldırır. Ayrıca, mikrokanallardan hızlı bir şekilde numune toplama yeteneği, geleneksel mekanik stimülasyon yaklaşımları kullanılarak elde edilemeyen büyük örneklem sayıları gerektiren -omik testler de dahil olmak üzere stimülasyon sonrası analizlere olanak tanır. Bu sistemin geometrisi, farklı biyolojik sistemlere kolayca ölçeklenebilir ve çok sayıda alanın, yüksek numune verimi, mekanik stimülasyon veya immobilizasyon ve otomatik hizalama dahil olmak üzere burada açıklanan işlevsel özelliklerden yararlanmasını sağlar.
Canlı sistemler, yaşamları boyunca çeşitli mekanik girdileri sürekli olarak deneyimlemekte ve bunlara yanıt vermektedir1. Mekanotransdüksiyon, gelişimsel bozukluklar, kas ve kemik kaybı ve mekanik ortamdan doğrudan veya dolaylı olarak etkilenen sinyal yolları yoluyla nöropatolojiler dahil olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir2. Bununla birlikte, mekanosensitif sinyal yolakları4’te mekanik stimülasyon3 ile düzenlenen genler ve proteinler büyük ölçüde bilinmemektedir5, mekanik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasını ve patolojik mekanotransdüksiyonla ilişkili hastalıklar için moleküler hedeflerin belirlenmesini engellemektedir 6,7 . Mekanobiyoloji çalışmalarının ilgili fizyolojik süreçlere yansıtılmasında sınırlayıcı bir faktör, bozulmamış çok hücreli organizmalar yerine geleneksel kültür çanaklarına sahip bireysel hücrelerin kullanılmasıdır. Drosophila melanogaster (meyve sineği) gibi model organizmalar, hayvan gelişiminde rol oynayan genlerin, sinyal yollarının ve proteinlerin anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur 8,9,10. Bununla birlikte, mekanobiyoloji araştırmalarında Drosophila ve diğer çok hücreli model organizmaların kullanılması, deneysel araçlarla ilgili zorluklarla engellenmiştir. Çeşitli uyaranları hazırlamak, sıralamak, görüntülemek veya uygulamak için kullanılan geleneksel teknikler çoğunlukla manuel manipülasyon gerektirir; Bu yaklaşımlar zaman alıcıdır, uzmanlık gerektirir, değişkenlik getirir ve deneysel tasarımı ve örneklem büyüklüğünü sınırlar11. Son mikroteknolojik gelişmeler, çok yüksek verim ve yüksek kontrollü deneysel parametrelere sahip yeni biyolojik tahlillerin etkinleştirilmesi için harika bir kaynaktır12,13,14.
Bu makalede, yüzlerce Drosophila embriyosuna tek eksenli sıkıştırma şeklinde mekanik stimülasyonu hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için geliştirilmiş bir mikroakışkan cihazın geliştirilmesi anlatılmaktadır15 (Şekil 1). Mikroakışkan sistemin bir cam kapak kayışı ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında numunelerin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülenmesini sağladı. Mikroakışkan cihaz ayrıca -omik tahlillerin çalıştırılması için stimülasyondan sonra embriyoların hızlı bir şekilde toplanmasını sağladı (Şekil 2). Bu cihazın tasarım hususlarının yanı sıra yumuşak litografi ve deneysel karakterizasyon kullanılarak yapılan imalatın açıklamaları burada açıklanmaktadır. Böyle bir cihazın silikon gofret kalıbını yapmak, yüksek en-boy oranlı (AR) hendeklere (AR >5) sahip geniş alanlar üzerinde kalın fotodirencin (kalınlık >200 μm) düzgün bir kaplamasını gerektirdiğinden, bu yöntem geleneksel fotolitografik kalıp imalat protokolünü önemli ölçüde değiştirdi. Bu şekilde, bu yöntem fotodirencin taşınmasını, yapışmasını, kaplanmasını, desenlenmesini ve geliştirilmesini kolaylaştırdı. Ek olarak, potansiyel tuzaklar ve çözümleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu tasarım ve üretim stratejisinin çok yönlülüğü, Drosophila yumurta odaları ve beyin organoidleri16 gibi diğer çok hücreli sistemler kullanılarak gösterilmiştir.
Makale, yüzlerce Drosophila embriyosuna mekanik stimülasyonu otomatik olarak hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için mikroakışkan bir cihazın geliştirilmesini açıklamaktadır. Mikroakışkan sistemin ince bir cam kapak kayması ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında embriyoların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini sağlamıştır. Mikroakışkan cihaz ayrıca, aşağı akış biyolojik tahlillerinin çalıştırılması için stim…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (CMMI-1946456), Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (FA9550-18-1-0262) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
Bleach | Not brand specific | ||
Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
NaCl | Not brand specific | ||
Oven | Labnet | I5110A | |
Paintbrush | Not brand specific | ||
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |