हाइड्रोज़ोन जेलीफिश क्लैडोनेमा पैसिफिकम में स्टेम जैसी कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन और 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन लेबलिंग
Summary
यहां, हम जेलीफिश क्लैडोनेमा में स्टेम जैसी प्रसार कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। स्टेम सेल मार्कर के साथ सीटू संकरण में होल-माउंट फ्लोरोसेंट स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और 5-एथिनाइल -2′-डीऑक्सीयूरिडिन लेबलिंग प्रसार कोशिकाओं की पहचान को सक्षम बनाता है। साथ में, सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है।
Abstract
समुद्री एनीमोन, कोरल और जेलीफिश सहित निडारियन, विविध आकृति विज्ञान और जीवन शैली का प्रदर्शन करते हैं जो सेसिल पॉलीप्स और फ्री-स्विमिंग मेडुसे में प्रकट होते हैं। जैसा कि हाइड्रा और नेमाटोस्टेला जैसे स्थापित मॉडलों में उदाहरण दिया गया है, स्टेम सेल और / या प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं निडारियन पॉलीप्स के विकास और उत्थान में योगदान करती हैं। हालांकि, अधिकांश जेलीफ़िश में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र, विशेष रूप से मेडुसा चरण में, काफी हद तक अस्पष्ट हैं, और इस प्रकार, विशिष्ट सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए एक मजबूत विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है। यह पेपर हाइड्रोज़ोन जेलीफिश क्लैडोनेमा पैसिफिकम में स्टेम जैसी प्रसार कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। क्लैडोनेमा मेडुसे के पास शाखित तम्बू होते हैं जो लगातार बढ़ते हैं और अपने वयस्क चरण में पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखते हैं, एक अनूठा मंच प्रदान करते हैं जिसके साथ प्रसार और / या स्टेम जैसी कोशिकाओं द्वारा आयोजित सेलुलर तंत्र का अध्ययन किया जाता है। स्टेम सेल मार्कर का उपयोग करके होल-माउंट फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण (फिश) स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, जबकि 5-एथिनाइल -2′-डीऑक्सीयूरिडिन (ईडीयू), एक एस चरण मार्कर के साथ पल्स लेबलिंग, प्रसार कोशिकाओं की पहचान को सक्षम बनाता है। फिश और ईडीयू लेबलिंग दोनों के संयोजन से, हम निश्चित जानवरों पर सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रसार का पता लगा सकते हैं, और इस तकनीक को गैर-मॉडल जेलीफिश प्रजातियों सहित अन्य जानवरों पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
Introduction
निडारिया को एक बेसल ब्रांचिंग मेटाज़ोन फाइलम माना जाता है जिसमें नसों और मांसपेशियों वाले जानवर होते हैं, जो उन्हें पशु विकास और शरीर विज्ञान 1,2 के विकास को समझने के लिए एक अनूठी स्थिति में रखते हैं। निडारियन को दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया गया है: एंथोज़ोआ (जैसे, समुद्री एनीमोन और कोरल) में केवल प्लानुला लार्वा और सेसिल पॉलीप चरण होते हैं, जबकि मेडुसोज़ोआ (हाइड्रोज़ोआ, स्टौरोज़ोआ, साइफोज़ोआ और कुबोज़ोआ के सदस्य) आमतौर पर फ्री-स्विमिंग मेडुसे, या जेलीफ़िश, साथ ही प्लानुला लार्वा और पॉलीप्स का रूप लेते हैं। निडारियन आमतौर पर उच्च पुनर्योजी क्षमता प्रदर्शित करते हैं, और उनके अंतर्निहित सेलुलर तंत्र, विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के उनके कब्जे ने बहुत ध्यान आकर्षित कियाहै। प्रारंभ में हाइड्रा में पहचाने गए, हाइड्रोज़ोन स्टेम सेल एक्टोडर्मल उपकला कोशिकाओं के बीच अंतरालीय रिक्त स्थान में स्थित होते हैं और आमतौर पर अंतरालीय कोशिकाओं या आई-कोशिकाओंके रूप में संदर्भित होते हैं।
हाइड्रोज़ोन आई-कोशिकाएं सामान्य विशेषताओं को साझा करती हैं जिनमें मल्टीपोटेंसी, व्यापक रूप से संरक्षित स्टेम सेल मार्करों (जैसे, नैनोस, पिवी, वासा) की अभिव्यक्ति और माइग्रेशन क्षमता 3,5,6,7,8 शामिल हैं। कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं के रूप में, आई-कोशिकाएं हाइड्रोज़ोन जानवरों के विकास, शरीर विज्ञान और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं में बड़े पैमाने पर शामिल होती हैं, जो उनकी उच्च पुनर्योजी क्षमता औरप्लास्टिसिटी 3 को प्रमाणित करती हैं। जबकि आई-कोशिकाओं के समान स्टेम कोशिकाओं को हाइड्रोज़ोन्स के बाहर नहीं पहचाना गया है, यहां तक कि स्थापित मॉडल प्रजातियों नेमाटोस्टेला में भी, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं अभी भी दैहिक ऊतक के रखरखाव और पुनर्जनन में शामिल हैं, साथ ही रोगाणु रेखा9 भी। चूंकि निडारियन विकास और पुनर्जनन में अध्ययन मुख्य रूप से पॉलीप-प्रकार के जानवरों जैसे हाइड्रा, हाइड्रैक्टिनिया और नेमाटोस्टेला पर आयोजित किए गए हैं, जेलीफिश प्रजातियों में स्टेम कोशिकाओं की सेलुलर गतिशीलता और कार्य काफी हद तक संबोधित नहीं किए गए हैं।
भूमध्य सागर और उत्तरी अमेरिका सहित दुनिया भर के विभिन्न आवासों के साथ एक महानगरीय जेलीफ़िश प्रजाति हाइड्रोज़ोन जेलीफ़िश क्लिटिया हेमिसफेरिका का उपयोग कई विकासात्मक और विकासवादीअध्ययनों में एक प्रयोगात्मक मॉडल जानवर के रूप में किया गया है। अपने छोटे आकार, आसान हैंडलिंग और बड़े अंडों के साथ, क्लिटिया प्रयोगशाला रखरखाव के लिए उपयुक्त है, साथ ही हाल ही में स्थापित ट्रांसजेनेसिस और नॉकआउट विधियों11 जैसे आनुवंशिक उपकरणों की शुरूआत के लिए, जेलीफिश जीव विज्ञान के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र के विस्तृत विश्लेषण का अवसर खोलता है। क्लिटिया मेडुसा टेंटेकल में, आई-कोशिकाओं को समीपस्थ क्षेत्र में स्थानीयकृत किया जाता है, जिसे बल्ब कहा जाता है, और नेमाटोब्लास्ट्स जैसे पूर्वज अलग-अलग सेल प्रकारों में अंतर करते हुए डिस्टल टिप पर चले जाते हैं, जिसमें नेमाटोसाइट्स12 भी शामिल हैं।
जेलीफिश के मौखिक अंग क्लिटिया मैनुब्रियम के पुनर्जनन के दौरान, नैनोस 1 + आई-कोशिकाएं जो गोनाड में मौजूद होती हैं, उस क्षेत्र में स्थानांतरित हो जाती हैं जहां क्षति के जवाब में मनुब्रियम खो जाता है और मैनुब्रियम7 के उत्थान में भाग लेता है। ये निष्कर्ष इस विचार का समर्थन करते हैं कि क्लिटिया में आई-कोशिकाएं कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं के रूप में भी व्यवहार करती हैं जो मॉर्फोजेनेसिस और पुनर्जनन में शामिल होती हैं। हालांकि, यह देखते हुए कि आई-कोशिकाओं के गुण प्रतिनिधि पॉलीप-प्रकार के जानवरों जैसे हाइड्रा और हाइड्रैक्टिनिया3 के बीच भिन्न होते हैं, यह संभव है कि स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं और कार्यों को जेलीफिश प्रजातियों के बीच विविध किया जाता है। इसके अलावा, क्लिटिया के अपवाद के साथ, प्रयोगात्मक तकनीकों को अन्य जेलीफिश के लिए सीमित किया गया है, और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं और स्टेम कोशिकाओं की विस्तृतगतिशीलता अज्ञात है।
हाइड्रोज़ोन जेलीफ़िश क्लैडोनेमा पैसिफिकम एक उभरता हुआ मॉडल जीव है जिसे पानी के पंप या निस्पंदन प्रणाली के बिना प्रयोगशाला वातावरण में रखा जा सकता है। क्लैडोनेमा मेडुसा में शाखित तम्बू हैं, जो क्लैडोनमेटिडे परिवार में एक आम विशेषता है, और बल्ब14 के पास एक्टोडर्मल परत पर ओसेलस नामक एक फोटोरिसेप्टर अंग है। तम्बू शाखाओं की प्रक्रिया एक नई शाखाओं की साइट पर होती है जो तम्बू के अक्षीय पक्ष के साथ दिखाई देती है। समय के साथ, तम्बू लम्बी और शाखाएं जारी रखते हैं, पुरानी शाखाओं को टिप15 की ओर धकेल दिया जाता है। इसके अलावा, क्लैडोनेमा टेंटेकल विच्छेदन पर कुछ दिनों के भीतर पुनर्जीवित हो सकते हैं। हाल के अध्ययनों ने क्लैडोनेमा16,17 में तम्बू शाखाओं और पुनर्जनन में कोशिकाओं और स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रसार की भूमिका का सुझाव दिया है। हालांकि, जबकि क्लैडोनेमा में जीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए पारंपरिक इन सीटू संकरण (आईएसएच) का उपयोग किया गया है, इसके कम रिज़ॉल्यूशन के कारण, वर्तमान में सेलुलर स्तर पर स्टेम सेल गतिशीलता का विस्तार से निरीक्षण करना मुश्किल है।
यह पेपर फिश द्वारा क्लैडोनेमा में स्टेम जैसी कोशिकाओं की कल्पना करने और ईडीयू के साथ सह-धुंधला करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो सेल प्रसार18 का एक मार्कर है। हम फिश द्वारा एक स्टेम सेल मार्कर 5,17 नैनोस 1 के अभिव्यक्ति पैटर्न की कल्पना करते हैं, जो एकल-सेल स्तर पर स्टेम जैसे सेल वितरण की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, ईडीयू लेबलिंग के साथ नैनोस 1 अभिव्यक्ति का सह-धुंधलापन सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं को अलग करना संभव बनाता है। स्टेम जैसी कोशिकाओं और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं दोनों की निगरानी के लिए इस विधि को जांच क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, जिसमें क्लैडोनेमा में टेंटेकल ब्रांचिंग, ऊतक होमियोस्टेसिस और अंग पुनर्जनन शामिल हैं, और इसी तरह का दृष्टिकोण अन्य जेलीफिश प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोलिफ़ेरिंग सेल और स्टेम सेल विभिन्न प्रक्रियाओं जैसे मोर्फोजेनेसिस, विकास और पुनर्जनन21,22 में महत्वपूर्ण सेलुलर स्रोत हैं। यह पेपर क्लैडोनेमा मेडुसे में फिश और ईडीयू लेब?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या जेपी 22 जीएम 6110025 (वाईएन के लिए) और जेएसपीएस काकेन्ही अनुदान संख्या 22 एच 02762 (वाईएन के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
Riferimenti
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Biologia dello sviluppo. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Biologia dello sviluppo. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Biologia dello sviluppo. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
