Fluorescerende in situ hybridisering og 5-etynyl-2'-deoksyuridinmerking for stamceller i hydrozoan maneter cladonema pacificum

Summary

Her beskriver vi en protokoll for visualisering av stammelignende prolifererende celler i maneten Cladonema. Helmontert fluorescerende in situ hybridisering med stamcellemarkør muliggjør påvisning av stamcellelignende celler, og 5-etynyl-2′-deoksyuridinmerking muliggjør identifisering av prolifererende celler. Sammen kan aktivt prolifererende stamcellelignende celler detekteres.

Abstract

Cnidarians, inkludert sjøanemoner, koraller og maneter, viser ulike morfologi og livsstil som manifesteres i sessile polypper og frittsvømmende medusae. Som eksemplifisert i etablerte modeller som Hydra og Nematostella, bidrar stamceller og / eller proliferative celler til utvikling og regenerering av cnidarian polypper. Imidlertid er de underliggende cellulære mekanismene i de fleste maneter, spesielt på medusa-stadiet, stort sett uklare, og det er derfor kritisk å utvikle en robust metode for å identifisere spesifikke celletyper. Dette papiret beskriver en protokoll for visualisering av stammelignende prolifererende celler i hydrozoan maneter Cladonema pacificum. Cladonema medusae har forgrenede tentakler som kontinuerlig vokser og opprettholder regenerativ kapasitet gjennom hele voksenstadiet, og gir en unik plattform for å studere de cellulære mekanismene orkestrert av prolifererende og / eller stamceller. Helmontert fluorescerende in situ hybridisering (FISH) ved hjelp av en stamcellemarkør muliggjør påvisning av stamcellelignende celler, mens pulsmerking med 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU), en S-fasemarkør, muliggjør identifisering av prolifererende celler. Ved å kombinere både FISH- og EdU-merking kan vi oppdage aktivt prolifererende stamceller på faste dyr, og denne teknikken kan brukes bredt på andre dyr, inkludert ikke-modellmanetarter.

Introduction

Cnidaria regnes som en basalt forgrening metazoan phylum som inneholder dyr med nerver og muskler, og plasserer dem i en unik posisjon for å forstå utviklingen av dyrs utvikling og fysiologi ^1,2. Cnidarians er kategorisert i to hovedgrupper: Anthozoa (f.eks. Sjøanemoner og koraller) har bare planula larver og sessile polyppstadier, mens Medusozoa (medlemmer av Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa og Cubozoa) vanligvis tar form av frittsvømmende medusae, eller maneter, samt planula larver og polypper. Cnidarians viser ofte høy regenerativ kapasitet, og deres underliggende cellulære mekanismer, spesielt deres besittelse av voksne stamceller og proliferative celler, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet ^3,4. Opprinnelig identifisert i Hydra, er hydrozoan stamceller lokalisert i interstitielle mellomrom mellom ektodermale epitelceller og blir ofte referert til som interstitielle celler eller i-celler³.

Hydrozoiske i-celler deler vanlige egenskaper som inkluderer multipotens, uttrykket av vidt konserverte stamcellemarkører (f.eks. Nanos, Piwi, Vasa) og migrasjonspotensial 3,5,6,7,8. Som funksjonelle stamceller er i-celler i stor grad involvert i utvikling, fysiologi og miljøresponser hos hydrozodyr, noe som vitner om deres høye regenerative kapasitet og^plastisitet. Mens stamceller, som ligner på i-celler, ikke er identifisert utenfor hydrozoer, selv i den etablerte modellarten Nematostella, er proliferative celler fortsatt involvert i vedlikehold og regenerering av somatisk vev, så vel som kimlinjen⁹. Ettersom studier i cnidarian utvikling og regenerering hovedsakelig har blitt utført på polyp-type dyr som Hydra, Hydractinia og Nematostella, forblir den cellulære dynamikken og funksjonene til stamceller i manetarter stort sett uadressert.

Hydrozomaneten Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk manetart med forskjellige habitater rundt om i verden, inkludert Middelhavet og Nord-Amerika, har blitt brukt som et eksperimentelt modelldyr i flere utviklings- og evolusjonære studier¹⁰. Med sin lille størrelse, enkle håndtering og store egg, er Clytia egnet for laboratorievedlikehold, samt for innføring av genetiske verktøy som de nylig etablerte transgenese- og knockoutmetodene¹¹, noe som åpner muligheten for detaljert analyse av de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for manetbiologi. I Clytia medusa tentacle er i-celler lokalisert i den proksimale regionen, kalt pæren, og forfedre som nematoblaster migrerer til distalspissen mens de differensierer i forskjellige celletyper, inkludert nematocytter¹².

Under regenerering av Clytia manubrium, det orale organet av maneter, migrerer Nanos1 ⁺ i-celler som er tilstede i gonadene til regionen der manubriumet går tapt som svar på skade og deltar i regenerering av manubrium⁷. Disse funnene støtter ideen om at i-celler i Clytia også oppfører seg som funksjonelle stamceller som er involvert i morfogenese og regenerering. Men gitt at egenskapene til i-celler er forskjellige blant representative polyp-type dyr som Hydra og Hydractinia³, er det mulig at egenskapene og funksjonene til stamceller er diversifisert blant manetarter. Videre, med unntak av Clytia, har eksperimentelle teknikker vært begrenset for andre maneter, og den detaljerte dynamikken til proliferative celler og stamceller er ukjent¹³.

Hydrozoan maneter Cladonema pacificum er en fremvoksende modellorganisme som kan holdes i et laboratoriemiljø uten vannpumpe eller filtreringssystem. Cladonema medusa har forgrenede tentakler, et vanlig kjennetegn i familien Cladonematidae, og et fotoreseptororgan kalt ocellus på ektodermallaget nær pæren¹⁴. Tentakelforgreningsprosessen skjer på et nytt forgreningssted som vises langs den adaksiale siden av tentakelen. Over tid fortsetter tentaklene å forlenge og forgrene seg, med de eldre grenene presset ut mot spissen¹⁵. I tillegg kan Cladenamas tentakler regenerere i løpet av få dager ved amputasjon. Nylige studier har antydet rollen som prolifererende celler og stamcellelignende celler i tentakelforgrening og regenerering i Cladonema^16,17. Men mens konvensjonell in situ hybridisering (ISH) har blitt brukt til å visualisere genuttrykk i Cladonema, på grunn av sin lave oppløsning, er det for tiden vanskelig å observere stamcelledynamikk på mobilnivå i detalj.

Dette papiret beskriver en metode for å visualisere stamcellelignende celler i Cladonema av FISH og co-farging med EdU, en markør for celleproliferasjon¹⁸. Vi visualiserer ekspresjonsmønsteret til Nanos1, en stamcellemarkør ^5,17, av FISH^, som gjør det mulig å identifisere stamcellelignende cellefordeling på enkeltcellenivå. I tillegg gjør co-farging av Nanos1-uttrykk med EdU-merking det mulig å skille aktivt prolifererende stamceller. Denne metoden for overvåking av både stamceller og proliferative celler kan brukes på et bredt spekter av undersøkelsesområder, inkludert tentakelforgrening, vevhomeostase og organregenerering i Cladonema, og en lignende tilnærming kan brukes på andre manetarter.

Protocol

MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen. 1. Sondesyntese RNA-ekstraksjonPlasser tre levende Cladonema medusae som dyrkes i kunstig sjøvann (ASW) i et 1,5 ml rør ved hjelp av en 3,1 ml overføringspipette med spissen avskåret, og fjern så mye ASW som mulig.MERK: ASW fremstilles ved å oppløse en blanding av mineralsalter i vann fra springen med kl…

Representative Results

Cladonema tentakler har blitt brukt som en modell for å studere de cellulære prosessene for morfogenese og regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består av et epitelrør hvor stamlignende celler, eller i-celler, befinner seg i det proksimale området, kalt tentakelpæren, og nye grener legges sekvensielt på baksiden av pærens distale region langs adaksialsiden (figur 3A)<sup class="x…

Discussion

Prolifererende celler og stamceller er viktige cellulære kilder i ulike prosesser som morfogenese, vekst og regenerering^21,22. Dette papiret beskriver en metode for co-farging av stamcellemarkøren Nanos1 ved FISH og EdU-merking i Cladonema medusae. Tidligere arbeid ved bruk av EdU eller BrdU-merking har antydet at proliferative celler lokaliserer til tentakelpærene^16,17, men deres mol…

Materials

2-Mercaptoethanol	Wako	137-06862
3.1 mL transfer pipette	Thermo Scientific	233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Wako	029-15043
anti-DIG-POD	Roche	11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer			5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer			5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer			5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer			5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	EdU kit
Coroline off	GEX Co. ltd	N/A	chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent	Roche	11175041910	blocking buffer
DIG RNA labeling mix	Roche	11277073910
DTT	Promega	P117B
ECOS competent cell DH5α	NIPPON GENE	316-06233	competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit	Fast gene	FG-91302	gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit	Fast gene	FG-90502	plasmid miniprep
Formamide	Wako	068-00426
Heparin sodium salt from porcine	SIGMA-ALDRICH	H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)	Wako	096-05143
LB Agar	Invitrogen	22700-025	agar plate
LB Broth Base	Invitrogen	12780-052	LB medium
Maleic acid	Wako	134-00495
mini Quick spin RNA columns	Roche	11814427001	clean-up column
NaCl	Wako	191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	Wako	166-21115
PowerMasher 2	nippi	891300	homogenizer
Proteinase K	Nacarai Tesque	29442-14
RNase Inhibitor	TaKaRa	2313A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74004	total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)	TaKaRa	T9172
SEA LIFE	Marin Tech	N/A	mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase	Roche	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche	10881767001
TAITEC HB-100	TAITEC	0040534-000	Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A	Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit	TaKaRa	6210A	cDNA synthesis kit
Target Clone	TOYOBO	TAK101	pTA2 Vector
tRNA	Roche	10109541001
TSA Plus Cyanine 5	AKOYA Biosciences	NEL745001KT	tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880	ZEISS	N/A	laser scanning confocal microscope