In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D
Summary
O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.
Abstract
Como ingrediente principal das vacinas, os adjuvantes podem induzir ou melhorar diretamente as respostas imunes poderosas, generalizadas, inatas e adaptativas associadas aos antígenos. Ophiopogonin D (OP-D), um componente purificado extraído da planta Ophiopogon japonicus, foi encontrado para ser útil como um adjuvante da vacina. Os problemas de baixa solubilidade e toxicidade do OP-D podem ser efetivamente superados usando um método de emulsificação de baixa energia para preparar a ofiopogonina D (NOD) em nanoemulsão. Neste artigo, uma série de protocolos in vitro para avaliação da atividade celular são examinados. Os efeitos citotóxicos da L929 foram determinados usando um ensaio kit-8 de contagem celular. Em seguida, os níveis de citocinas secretadas e o número de células imunes correspondentes após a estimulação e cultura de esplenócitos de camundongos imunizados foram detectados pelos métodos ELISA e ELISpot. Além disso, a capacidade de captação de antígenos em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs), que foram isoladas de camundongos C57BL/6 e amadurecidas após incubação com GM-CSF mais IL-4, foi observada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). É importante ressaltar que a ativação de macrófagos foi confirmada pela medição dos níveis de citocinas IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por kits ELISA após a cocultura de macrófagos peritoneais (PMs) de camundongos em branco com o adjuvante por 24 h. Espera-se que este protocolo forneça a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais.
Introduction
As vacinas são um meio importante de prevenir e tratar doenças infecciosas e não transmissíveis. A adição adequada de adjuvantes e veículos de entrega às formulações de vacinas é benéfica para aumentar a imunogenicidade dos antígenos e gerar respostas imunes duradouras1. Além do alúmen adjuvante clássico (sal de alumínio), existem seis tipos de adjuvantes para vacinas que são atualmente comercializados: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Geralmente, quando o corpo humano encontra um ataque viral, a primeira e a segunda linhas de defesa (pele, mucosa e macrófagos) assumem a liderança na limpeza do vírus e, finalmente, a terceira linha de defesa, envolvendo os órgãos imunológicos e as células imunes, é ativada. O alumínio e os sais de alumínio têm sido os adjuvantes mais utilizados para vacinas humanas desde o início da década de 1920, provocando uma resposta imune inata eficaz6. No entanto, tem sido proposto que a ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) por adjuvantes clássicos, que estimula as células imunes a gerar conjuntos específicos de citocinas e quimiocinas, é o mecanismo pelo qual os adjuvantes funcionam e pode ser uma das razões pelas quais os adjuvantes exercem apenas efeitos transitórios sobre respostas imunes específicas7. A presença de adjuvantes licenciados limitados para uso humano é um fator restritivo para o desenvolvimento de vacinas que provocam respostas imunes eficazes8.
Atualmente, um número crescente de estudos adjuvantes está demonstrando a capacidade de induzir uma forte resposta imune celular em camundongos. Demonstrou-se que o QS-21 induz uma resposta imune equilibrada do T-helper 1 (Th1) e do T-helper 2 (Th2), produz níveis mais altos de títulos de anticorpos e prolonga a proteção como adjuvante, mas sua forte toxicidade e propriedades hemolíticas limitam seu desenvolvimento como adjuvante clínico autônomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranosídeo) é uma das saponinas esteroides isoladas da raiz da planta medicinal chinesa Ophiopogon japonicas4. Além disso, é o principal componente farmacologicamente ativo (Shen Mai San) encontrado em Radix Ophiopogonis e é conhecido por ter certas propriedades farmacológicas11. Além disso, é um membro da família Liliaceae e é amplamente utilizado por seus efeitos inibitórios e protetores na inflamação celular e lesão miocárdica. Por exemplo, o OP-D melhora as lesões semelhantes à dermatite atópica induzidas por DNCB e as células inflamatórias HaCaT do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em camundongos BALB/c12. É importante ressaltar que o OP-D promove a proteção antioxidante do sistema cardiovascular e protege o coração contra a lesão autofágica induzida pela doxorrubicina, reduzindo a geração de espécies reativas de oxigênio e interrompendo os danos na membrana mitocondrial. Experimentos mostraram que tomar OP-D com monodesmosídeo ajuda a aumentar a saúde imunológica, aumentar a contagem de glóbulos brancos e a síntese de DNA e fazer com que os anticorpos durem maistempo 13. Verificou-se anteriormente que o OP-D tem um efeito adjuvante14.
As nanoemulsões são nanoformulações de óleo em água compostas por uma combinação de surfactantes, óleo, cosurfactantes e água12,15. Esses desenhos de nanovacinas permitem que antígenos e adjuvantes sejam encapsulados juntos para melhorar a estimulação imunológica, proteger os antígenos e promover a maturação das células dendríticas (DC)16. Para o desenvolvimento desses novos adjuvantes obtidos a partir da triagem, é importante encontrar métodos apropriados para avaliar suas habilidades de resposta celular.
O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente se os adjuvantes podem aumentar a fagocitose e a expressão de células imunes em cultura de células in vitro e elaborar os principais métodos experimentais. O experimento é dividido em quatro subseções: (1) a toxicidade das células OP-D e NOD para L929 é determinada pelo ensaio kit-8 de contagem de células (CCK-8); (2) os níveis de citocinas de IFN-γ endócrino e IL-17A e os números celulares correspondentes em camundongos imunizados são detectados por estimulação de esplenócitos e ensaios de ELISpot; (3) a capacidade de apresentação do antígeno das CDs após estimulação adjuvante é observada por microscopia confocal; e (4) são detectados os três tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nos sobrenadantes obtidos de macrófagos peritoneais (PMs) em camundongos normais cocultivados com adjuvantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
As vacinas de subunidade fornecem excelente segurança, mas baixa imunogenicidade. A principal estratégia para aumentar a imunogenicidade é adsorver fisicamente ou acoplar antígenos com adjuvantes e incorporá-los aos sistemas de liberação de fármacos para promover a captação e apresentação por CDs. As saponinas vegetais naturais, como a saponina quillaia e seus derivados, são altamente tóxicas e não são adequadas para o desenvolvimento de vacinas humanas17. Portanto, o estudo dos ef…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China, bolsas nº 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 do Programa Nacional da Fundação de Ciências Naturais da China, bolsas nº 2014jcyjA0107 e nº 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, concessão nº CYS21519 do Projeto de Pesquisa e Inovação de Pós-Graduação de Chongqing, concessão nº 2020XBK24 dos projetos especiais da Universidade Médica do Exército e concessão nº 202090031021 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
Riferimenti
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
