In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D
Summary
Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.
Abstract
Als hoofdingrediënt van vaccins kunnen adjuvantia de krachtige, wijdverspreide, aangeboren en adaptieve immuunresponsen geassocieerd met antigenen direct induceren of verbeteren. Ophiopogonine D (OP-D), een gezuiverd bestanddeel geëxtraheerd uit de plant Ophiopogon japonicus, is nuttig gebleken als vaccinadjuvans. De problemen van de lage oplosbaarheid en toxiciteit van OP-D kunnen effectief worden overwonnen door een laagenergetische emulgeringsmethode te gebruiken om nano-emulsie ophiopogonine D (NOD) te bereiden. In dit artikel wordt een reeks in vitro protocollen voor cellulaire activiteitsevaluatie onderzocht. De cytotoxische effecten van L929 werden bepaald met behulp van een celtelkit-8-test. Vervolgens werden de uitgescheiden cytokineniveaus en bijbehorende immuuncelnummers na de stimulatie en kweek van splenocyten van geïmmuniseerde muizen gedetecteerd door ELISA- en ELISpot-methoden. Bovendien werd het antigeenopnamevermogen in beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDC’s), die werden geïsoleerd uit C57BL / 6-muizen en rijpten na incubatie met GM-CSF plus IL-4, waargenomen door laserscanning confocale microscopie (CLSM). Belangrijk is dat macrofaagactivatie werd bevestigd door het meten van de niveaus van IL-1β, IL-6 en tumornecrosefactor alfa (TNF-α) cytokines door ELISA-kits na het cocultureren van peritoneale macrofagen (PM’s) van blanco muizen met het adjuvans gedurende 24 uur. Gehoopt wordt dat dit protocol andere onderzoekers directe en effectieve experimentele benaderingen zal bieden om de cellulaire responseffectiviteit van nieuwe vaccinadjuvantia te evalueren.
Introduction
Vaccins zijn een belangrijk middel om infectieuze en niet-overdraagbare ziekten te voorkomen en te behandelen. De juiste toevoeging van adjuvantia en toedieningsvoertuigen aan vaccinformuleringen is gunstig voor het verbeteren van de immunogeniciteit van antigenen en het genereren van langdurige immuunresponsen1. Naast de klassieke adjuvante aluin (aluminiumzout), zijn er zes soorten adjuvantia voor vaccins die momenteel op de markt worden gebracht: MF59 2,3, AS043, AS033, AS013, CpG10184 en Matrix-M5. Over het algemeen, wanneer het menselijk lichaam een virale aanval tegenkomt, nemen de eerste en tweede verdedigingslinie (huid, slijmvlies en macrofagen) het voortouw bij het opruimen van het virus, en ten slotte wordt de derde verdedigingslinie, waarbij de immuunorganen en immuuncellen betrokken zijn, geactiveerd. Aluminium- en aluminiumzouten zijn sinds de vroege jaren 1920 de meest gebruikte adjuvantia voor menselijke vaccins, die een effectieve aangeboren immuunrespons opwekken6. Er is echter voorgesteld dat de activering van antigeen-presenterende cellen (APC’s) door klassieke adjuvantia, die de immuuncellen stimuleert om specifieke sets cytokines en chemokines te genereren, het mechanisme is waarmee adjuvantia werken en een van de redenen kan zijn waarom adjuvantia alleen voorbijgaande effecten uitoefenen op specifieke immuunresponsen7. De aanwezigheid van beperkte gelicentieerde adjuvantia voor menselijk gebruik is een beperkende factor voor het ontwikkelen van vaccins die effectieve immuunresponsen opwekken8.
Momenteel tonen steeds meer adjuvante studies het vermogen aan om een sterke cellulaire immuunrespons bij muizen te induceren. Van QS-21 is aangetoond dat het een gebalanceerde T-helper 1 (Th1) en T-helper 2 (Th2) immuunrespons induceert, hogere niveaus van antilichaamtiters produceert en de bescherming als adjuvans verlengt, maar de sterke toxiciteit en hemolytische eigenschappen beperken de ontwikkeling ervan als een op zichzelf staand klinisch adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenine-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) is een van de steroïde saponinen geïsoleerd uit de wortel van de Chinese medicinale plant Ophiopogon japonicas4. Bovendien is het de belangrijkste farmacologisch actieve component (Shen Mai San) gevonden in Radix Ophiopogonis en is bekend dat het bepaalde farmacologische eigenschappenheeft 11. Bovendien is het een lid van de Liliaceae-familie en wordt het op grote schaal gebruikt voor zijn remmende en beschermende effecten bij cellulaire ontsteking en myocardiale schade. OP-D verbetert bijvoorbeeld DNCB-geïnduceerde atopische dermatitis-achtige laesies en tumornecrosefactor alfa (TNF-α) inflammatoire HaCaT-cellen in BALB / c-muizen12. Belangrijk is dat OP-D de antioxidatieve bescherming van het cardiovasculaire systeem bevordert en het hart beschermt tegen doxorubicine-geïnduceerde autofagische schade door zowel reactieve zuurstofsoortengeneratie te verminderen als mitochondriale membraanschade te verstoren. Experimenten hebben aangetoond dat het nemen van OP-D met mono-desmoside helpt om de immuungezondheid te stimuleren, het aantal witte bloedcellen en de DNA-synthese te verhogen en antilichamen langer te laten duren13. Eerder is gebleken dat OP-D een adjuvans effect heeft14.
Nano-emulsies zijn olie-in-water nanoformulaties samengesteld uit een combinatie van oppervlakteactieve stoffen, olie, cosurfactanten en water12,15. Met deze nanovaccinontwerpen kunnen antigenen en adjuvantia samen worden ingekapseld om de immuunstimulatie te verbeteren, de antigenen te beschermen en de rijping van dendritische cellen (DC) te bevorderen16. Voor de ontwikkeling van deze nieuwe adjuvantia verkregen uit screening, is het belangrijk om geschikte methoden te vinden om hun cellulaire responsvermogen te evalueren.
Het doel van dit protocol is om systematisch te evalueren of adjuvantia fagocytose en de expressie van immuuncellen in in vitro celkweek kunnen verbeteren en om de belangrijkste experimentele methoden uit te werken. Het experiment is verdeeld in vier subsecties: (1) de toxiciteit van OP-D- en NOD-cellen voor L929-cellen wordt bepaald door de celtelkit-8 (CCK-8) -test; (2) de cytokinespiegels van endocriene IFN-γ en IL-17A en de overeenkomstige celaantallen bij geïmmuniseerde muizen worden gedetecteerd door splenocytenstimulatie en ELISpot-assays; (3) het antigeen presentatievermogen van DC’s na adjuvante stimulatie wordt waargenomen met behulp van confocale microscopie; en (4) de drie soorten cytokines, IL-1β, IL-6 en TNF-α, in de supernatanten verkregen uit peritoneale macrofagen (PM’s) in normale muizen die gecocultureerd zijn met adjuvantia worden gedetecteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subunitvaccins bieden uitstekende veiligheid, maar slechte immunogeniciteit. De belangrijkste strategie om de immunogeniciteit te verbeteren is om antigenen fysiek te adsorberen of te koppelen met adjuvantia en deze op te nemen in de toedieningssystemen voor geneesmiddelen om de opname en presentatie door DC’s te bevorderen. Natuurlijke plantensaponinen zoals quillaia saponine en zijn derivaten zijn zeer giftig en zijn niet geschikt voor de ontwikkeling van menselijke vaccins17. Daarom is de studi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidie nr. 2021YFC2302603 van het National Key Research and Development Program van China, subsidies nr. 31670938, 32070924, 82041045 en 32000651 van het National Natural Science Foundation Program of China, subsidies nr. 2014jcyjA0107 en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing, subsidie nr. CYS21519 van het Postgraduate Research and Innovation Project van Chongqing, subsidie nr. 2020XBK24 van de Army Medical University Speciale projecten en subsidie nr. 202090031021 van het National Innovation and Entrepreneurship Program voor studenten.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
Riferimenti
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
