Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Summary

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Abstract

Com eficiência, precisão e facilidade excepcionais, o sistema CRISPR/Cas9 melhorou significativamente a edição do genoma em experimentos de cultura de células e animais de laboratório. Ao gerar modelos animais, a eletroporação de zigotos oferece maior eficiência, simplicidade, custo e rendimento como uma alternativa ao método padrão-ouro de microinjeção. A eletroporação também é mais suave, com maior viabilidade, e fornece de forma confiável as ribonucleoproteínas (RNPs) Cas9/RNA de guia única (sgRNA) nos zigotos de linhagens comuns de camundongos de laboratório (por exemplo, C57BL/6J e C57BL/6N) que se aproximam de 100% de eficiência de entrega. Esta técnica permite a inserção/deleção (indels) mutações, mutações pontuais, a deleção de genes inteiros ou éxons, e pequenas inserções na faixa de 100-200 pb para inserir LoxP ou tags curtas como FLAG, HA ou V5. Embora constantemente aprimorados, aqui apresentamos o estado atual do CRISPR-EZ em um protocolo que inclui a produção de sgRNA através da transcrição in vitro, processamento embrionário , montagem de RNP, eletroporação e genotipagem de embriões pré-implantação. Um pesquisador de nível de pós-graduação com experiência mínima na manipulação de embriões pode obter embriões geneticamente editados em menos de 1 semana usando este protocolo. Aqui, oferecemos um método simples, de baixo custo, eficiente e de alta capacidade que pode ser usado com embriões de camundongos.

Introduction

A edição do genoma em camundongos vivos foi consideravelmente simplificada e tornou-se acessível e mais acessível desde o surgimento da edição CRISPR ^1,2,3. Tentativas iniciais de edição animal utilizaram microinjeção para entregar mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear ^4,5,6. Embora a microinjeção seja bastante eficaz, a quantidade de prática necessária para dominá-la totalmente pode não ser apropriada para estagiários e estudantes e também requer equipamentos caros que um laboratório modestamente financiado não pode pagar. A microinjeção é normalmente realizada por técnicos especializados em instalações transgênicas com horários e preços de serviços que limitam a taxa para muitos pesquisadores. Uma abordagem mais acessível é a da eletroporação, que tem se mostrado bastante eficaz para a entrega de mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear⁷. Outras melhorias nas estratégias de edição e entrega do genoma CRISPR sugeriram que RNPs pré-montados já envolvidos com sgRNAs podem ser um meio eficaz para reduzir o mosaicismo⁸.

A lógica por trás do desenvolvimento e uso deste protocolo foi ignorar muitas das limitações e obstáculos associados à microinjeção. Como o nome indica, um método fácil, interno e econômico que pudesse determinar rapidamente se os projetos de sgRNA não testados valeriam a pena usar durante um experimento de microinjeção seria uma etapa de controle de qualidade de primeira passagem muito conveniente (Figura 1). Embora esse método não possa substituir a microinjeção por estratégias mais complexas, como a introdução de longas sequências de DNA de doadores para resultados baseados em recombinação, é ideal para estratégias menos complexas, como pequenas deleções ou inserções e genes de marcação. Este método é apropriado para pesquisadores com habilidades básicas de manipulação de embriões que têm necessidades simples de edição, gostariam de testar sua hipótese dentro do período de tempo de desenvolvimento pré-implantacional ou preferem testar sgRNAs em embriões antes de agendar uma consulta com um especialista em microinjeção. Aqui, os reagentes de edição são entregues transitoriamente em embriões de estágio pronuclear como RNPs Cas9/sgRNA via eletroporação (uma série de pulsos elétricos) para maximizar a eficiência enquanto diminui o mosaicismo⁸. Usando um método de genotipagem embrionária, os resultados da edição estão disponíveis em aproximadamente 1 semana⁹, reduzindo assim a necessidade de várias aplicações de microinjeção a um custo significativamente reduzido.

A eficácia desse método atinge o pico no estágio embrionário pró-nuclear, quando o embrião ainda não fundiu os pronúcleos materno e paterno ou entrou na fase S (Figura 2). A superovulação é usada para maximizar o número de zigotos, mas produz zigotos pró-nucleares e óvulos não fertilizados. Zigotos saudáveis também podem ser pré-selecionados antes da eletroporação para aumentar a eficiência geral. Como outros protocolos de eletroporação têm editado zigotos de forma eficiente sem a necessidade de incluir uma etapa semelhante^{7,10,11,12,13,14,15,} uma etapa opcional deste protocolo é a ligeira erosão da zona pelúcida (ZP). A ZP é uma camada de glicoproteína que auxilia a ligação dos espermatozoides, a resposta do acrossoma e a fertilização em torno de embriões em estágio pró-nuclear. Em nossa experiência, descobrimos que uma erosão suave à base de ácido do ZP fornece entrega confiável de eletroporação de RNP Cas9 com apenas um impacto marginal na viabilidade.

Observamos taxas de entrega de RNP de até 100% de eficiência via eletroporação em cepas de camundongos que são comumente utilizadas em pesquisas como C57BL/6J e C57BL/6N ^9,16. Grupos independentes também desenvolveram procedimentos baseados em eletroporação com eficiências maiores ou correspondentes à microinjeção 11,12,13,14,15,17, com protocolos de eletroporação funcionando bem em ratos ^18,19, suínos 20,21,22 e vacas ²³ , por isso, sugerimos que os leitores comparem os protocolos para encontrar as condições que melhor se adequam às suas necessidades experimentais e de equipamento. O sistema descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns, exigindo apenas habilidades básicas de manipulação de embriões. Esta técnica é eficaz para uma série de estratégias de edição, tornando este método amplamente acessível à comunidade de pesquisa.

Projetar RNAs de guia pequeno ideais (sgRNAs) é essencial para uma edição eficiente. Recomendamos o rastreamento de duas a três estratégias de sgRNA por local-alvo diretamente em embriões de camundongos, especialmente se a geração de linhagem de camundongo for desejada. Uma vez projetados, métodos livres de clonagem, como a transcrição in vitro (IVT) para produzir sgRNAs de alta qualidade, são recomendados³. Os RNPs e sgRNAs são misturados com 30-50 embriões processados em estágio pronuclear e expostos a uma série de pulsos elétricos para primeiro permeabilizar temporariamente o ZP e a membrana celular, com pulsos subsequentes para manter os poros abertos e eletroforese os RNPs através do zigoto²⁴. Após otimização, descobrimos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriões a granel (~50) foram ótimos para a eficácia e viabilidade da edição, proporcionando uma entrega de RNP Cas9/sgRNA altamente eficiente ^9,16,25. Eventos de edição em morula de camundongo individual podem ser confirmados usando uma variedade de estratégias de validação comuns para edição CRISPR, como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), digestão de endonuclease T7 e sequenciamento de Sanger da região de interesse²⁶.

O método atual é mais apropriado para esquemas de edição simples (Figura 3), como inserção/exclusão (indels), exclusões de tamanho exonário na ordem de 500-2000 pb e a entrega de mutações pontuais e pequenas inserções, como tags C- ou N-Terminal (por exemplo, FLAG, HA ou V5)^9,16,27. O potencial para a edição complexa do genoma, como grandes inserções de tags fluorescentes ou alelos condicionais, permanece incerto e é o foco atual das próximas melhorias.

Este método é facilmente dominado e pode ser usado para testar rapidamente sgRNAs em embriões de camundongos cultivados em 1 semana⁹ (Figura 1). Apresentado neste trabalho é um protocolo de seis etapas, que inclui 1) desenho de sgRNA; 2) síntese de sgRNA; 3) superovulação e acasalamento; 4) cultura, coleta e processamento de embriões; 5) Montagem e eletroporação da RNP; 6) cultura embrionária e genotipagem. Informações sobre todos os materiais utilizados são fornecidas (Tabela de Materiais). Como controle positivo, os reagentes para edição do locus tirosinase (Tyr) ^9,16 foram incluídos na Tabela Suplementar 1.

Protocol

Todos os cuidados e uso de animais ao longo deste protocolo aderiram às políticas da Lei de Bem-Estar Animal do Guia ILAR para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e seguiram as diretrizes e políticas da AVMA para eutanásia e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia (IACUC). O protocolo de cuidado e uso de animais foi revisado e aprovado pela IACUC da Universidade da Pensilvânia para este projeto. Por uma questão de conformidade e cautela, por favor, procure todas as…

Representative Results

Este método gera mais de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentração de 6.000 ng/L) para uma montagem eficiente do RNP Cas9/sgRNA. O método de superovulação de rotina descrito aqui normalmente produz 10-20 embriões viáveis por fêmea entupida. Devido a erros de manuseio e perdas típicas associadas à manipulação embrionária, espera-se que 80% dos embriões sejam fertilizados, viáveis e em excelente condição após a eletroporação. Para ajudar os pesquisadores a executar um experimento bem-sucedido, fornecemo…

Discussion

Apresentamos aqui uma tecnologia de edição de genoma de camundongo direta e altamente eficiente. A eletroporação pode ser usada para gerar embriões modificados em 1-2 semanas (Figura 1) e pode produzir camundongos editados dentro de 6 semanas⁹. Em comparação com protocolos baseados em eletroporação desenvolvidos contemporaneamente que fornecem RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32, o método descrito aqui é conceitualmente semelhante e ofere…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer