Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Joo-Hui Han; Rebecca E. Tweedell; Thirumala-Devi Kanneganti

doi:10.3791/64308

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

3.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/64308

⸱

20 gennaio 2023

Joo-Hui Han¹ , Rebecca E. Tweedell¹ , Thirumala-Devi Kanneganti¹

¹Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Abstract

L'immunità innata fornisce la prima linea di difesa critica in risposta agli agenti patogeni e agli insulti sterili. Una componente meccanicistica chiave di questa risposta è l'inizio della morte cellulare immunoprogrammata innata (PCD) per eliminare le cellule infette o danneggiate e propagare le risposte immunitarie. Tuttavia, l'eccesso di PCD è associato a infiammazione e patologia. Pertanto, la comprensione dell'attivazione e della regolazione della PCD è un aspetto centrale della caratterizzazione delle risposte immunitarie innate e dell'identificazione di nuovi bersagli terapeutici in tutto lo spettro della malattia.

Questo protocollo fornisce metodi per caratterizzare l'attivazione immunitaria innata della PCD monitorando le caspasi, una famiglia di proteasi dipendenti dalla cisteina che sono spesso associate a diversi percorsi di PCD, tra cui apoptosi, piroptosi, necroptosi e PANoptosi. I rapporti iniziali hanno caratterizzato la caspasi-2, la caspasi-8, la caspasi-9 e la caspasi-10 come caspasi iniziatrici e le caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7 come caspasi effettrici nell'apoptosi, mentre studi successivi hanno scoperto che le caspasi infiammatorie, caspasi-1, caspasi-4, caspasi-5 e caspasi-11, guidano la piroptosi. È ormai noto che esiste un'ampia diafonia tra le caspasi e altre molecole innate di morte immunitaria e cellulare attraverso i percorsi PCD precedentemente definiti, identificando una lacuna di conoscenza chiave nella comprensione meccanicistica dell'immunità innata e della PCD e portando alla caratterizzazione della PANoptosis. La PANoptosi è una via PCD infiammatoria immunitaria innata unica regolata da complessi PANoptosoma, che integrano componenti, comprese le caspasi, da altre vie di morte cellulare.

Qui vengono forniti metodi per valutare l'attivazione delle caspasi in risposta a vari stimoli. Questi metodi consentono la caratterizzazione delle vie della PCD sia in vitro che in vivo, poiché le caspasi attivate subiscono una scissione proteolitica che può essere visualizzata mediante western blotting utilizzando anticorpi e condizioni di blotting ottimali. Sono stati stabiliti un protocollo e un flusso di lavoro western blotting che consentono la valutazione dell'attivazione di più caspasi dalla stessa popolazione cellulare, fornendo una caratterizzazione completa dei processi PCD. Questo metodo può essere applicato in tutte le aree di ricerca in sviluppo, omeostasi, infezione, infiammazione e cancro per valutare i percorsi PCD attraverso i processi cellulari in salute e malattia.

Introduzione

Il sistema immunitario innato agisce come prima linea di difesa durante l'infezione e in risposta a stimoli sterili, come lesioni tissutali e alterazioni dell'omeostasi. I sensori immunitari innati sulla superficie cellulare e nel citoplasma rispondono ai modelli molecolari associati a patogeni o danni (PAMP o DAMP, rispettivamente) per innescare vie di segnalazione infiammatoria e risposte cellulari. Uno dei processi chiave della risposta immunitaria innata è l'induzione della morte cellulare per rimuovere le cellule infette o danneggiate e guidare ulteriori risposte immunitarie innate e adattative. La morte cellulare programmata (PCD) è un processo altamente conserv....