マウスの胸腺内注射のための低侵襲、正確、効率的な技術
Summary
本プロトコルは、開腹手術のリスクを回避し、盲検経皮的注射の精度を向上させるためにマウスの胸腺内注射のために確立されたインターベンショナルラジオロジー手順について説明しています。
Abstract
マウスモデルにおける胸腺内注射は、遺伝的および後天性T細胞障害を含む胸腺および免疫機能を研究するための重要な技術です。これには、試薬および/または細胞を生きているマウスの胸腺に直接沈着させる方法が必要です。胸腺内注射の伝統的な方法には、胸部手術または低侵襲経皮的盲検注射が含まれますが、どちらも重大な制限があります。超高周波超音波イメージング装置により、マウスへの画像誘導経皮注射が可能になり、経皮的注射アプローチの注入精度が大幅に向上し、より小さなターゲットの注入が可能になりました。ただし、画像誘導注入は統合されたレールシステムの利用に依存しているため、これは厳格で時間のかかる手順になります。ここでは、マウスの経皮的胸腺内注射のためのユニークで安全かつ効率的な方法を紹介し、注射のためのレールシステムへの依存を排除します。この技術は、高解像度のマイクロ超音波ユニットを使用してマウス胸腺を非侵襲的に画像化することに依存しています。フリーハンド技術を使用して、放射線科医は超音波検査ガイダンスの下で針先をマウス胸腺に直接配置することができます。マウスは、イメージングの前に洗浄および麻酔される。超音波ガイド下手順に長けた経験豊富な放射線科医にとって、述べられた技術の学習期間は非常に短く、通常は1セッション以内です。この方法は、マウスの罹患率および死亡率が低く、経皮的注射のための現在の機械的支援技術よりもはるかに高速である。これにより、研究者は、動物へのストレスを最小限に抑えながら、あらゆるサイズの胸腺(高齢マウスや免疫不全マウスの胸腺などの非常に小さな臓器を含む)の正確で信頼性の高い経皮注射を効率的に行うことができます。この方法は、必要に応じて個々のローブの注入を可能にし、手順の時間を節約する性質のために大規模な実験を容易にします。
Introduction
胸腺は、T細胞の発生と免疫に不可欠な役割を果たしています。胸腺退縮、遺伝性疾患、感染症、癌治療などの要因によって引き起こされる可能性のあるT細胞欠乏症は、高い死亡率と罹患率につながります1,2。マウスモデルは、基礎免疫学研究とトランスレーショナル免疫学研究の両方に不可欠であり、胸腺生物学とT細胞発生の研究、ならびに胸腺機能障害とT細胞欠乏症に苦しむ人々の治療法の開発に何十年にもわたって使用されてきました3,4,5。
胸腺研究の中心的な部分は、マウスモデル6、7、8、9、10、11、12における細胞、遺伝子、またはタンパク質などの生物学的物質の胸腺内注射でした。従来の胸腺内注射法は、開胸術とそれに続く直接可視化下での胸腺内注射、または縦隔への「盲検」経皮注射を使用する。外科的アプローチは、とりわけ気胸のリスクを大幅に増加させます。さらに、この手術中のストレスの上昇は免疫抑制をもたらし、したがって免疫学的データを損なう可能性があります13。経験豊富な研究者は、ある程度の練習の後、ブラインド注射技術を実行できますが、このアプローチは精度が低いため、実験対象を胸腺の大きな若いマウスに限定します。
超音波ガイダンスの利用は、従来の胸腺内注射アプローチに代わる正確で低侵襲の代替手段として導入されています14。ただし、この手順は、フリーハンド技術の代わりに統合レールシステムを使用する場合に非常に時間がかかります。インジェクションマウントを使用して注入を行うには、トランスデューサのスタンドとマウント、X、Y、Zポジショニングシステムなどのさまざまなアタッチメントを使用したトランスデューサの慎重なイメージングの最適化と位置決め、およびマイクロマニピュレーションコントロールとレールシステムエクステンションの熟練した操作が必要です。簡単な代替技術である超音波ガイド下胸腺注射が、上記の方法に対する迅速かつ正確な低侵襲代替手段であるフリーハンドアプローチ15を使用して放射線科医によって実行されることをここに提示する。重要なことに、現在のアプローチは、注入マウントと統合されたレールシステムを必要とせずに、高解像度の超音波イメージングシステムで実行できます。これは、多数のマウス11の注射を必要とする研究、両方の胸腺葉の注射を含む実験、または老化、照射、または免疫不全マウス12における小さな胸腺の正確な注射に特に有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
超音波ガイドフリーハンド注射は、効率的かつ無菌的な方法で胸腺に研究材料を送達するための非常に正確な技術です。注射部位での皮膚の最初の滅菌に続いて、滅菌手袋、滅菌超音波プローブカバー、および滅菌超音波ゲルの使用により、処置中に無菌性が維持されます。マウスの胸腺内注射に一般的に使用される方法である胸腺18,19の直接視覚化のための外科的切開に?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レイモンドH.ソーントンがこのテクニックに関する洞察に満ちた包括的な初期の研究をしてくれたことに感謝します。この研究は、国立がん研究所(NCI 1R37CA250661-01A1)、小児白血病研究協会、ハッケンサックメリディアン医学部、およびHUMC財団/タックルキッズがんからの助成金によって資金提供されました。
Materials
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
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