Detta protokoll beskriver ett interventionellt radiologiförfarande som fastställts för intratymisk injektion hos möss för att undvika risken för öppen kirurgi och förbättra noggrannheten hos blinda perkutana injektioner.
Intratymisk injektion i musmodeller är en viktig teknik för att studera tymisk och immunfunktion, inklusive genetiska och förvärvade T-cellstörningar. Detta kräver metoder för direkt avsättning av reagenser och/eller celler i tymus hos levande möss. Traditionella metoder för intratymisk injektion inkluderar thoraxkirurgi eller minimalt invasiva perkutana blinda injektioner, som båda har betydande begränsningar. Ultrahögfrekventa ultraljudsavbildningsenheter har möjliggjort bildstyrda perkutana injektioner hos möss, vilket avsevärt förbättrar injektionsnoggrannheten för den perkutana injektionsmetoden och möjliggör injektion av mindre mål. Bildstyrda injektioner är dock beroende av användningen av ett integrerat järnvägssystem, vilket gör detta till en styv och tidskrävande procedur. En unik, säker och effektiv metod för perkutana intratymiska injektioner hos möss presenteras här, vilket eliminerar beroendet av skensystemet för injektioner. Tekniken bygger på att använda en högupplöst mikro-ultraljudsenhet för att avbilda mustymus noninvasivt. Med hjälp av en frihandsteknik kan en radiolog placera en nålspets direkt i mustymusen under sonografisk vägledning. Möss rengörs och bedövas före avbildning. För en erfaren radiolog som är skicklig på ultraljudsstyrda procedurer är inlärningsperioden för den angivna tekniken ganska kort, vanligtvis inom en session. Metoden har låg sjuklighet och dödlighet för mössen och är mycket snabbare än nuvarande mekaniskt assisterade tekniker för perkutan injektion. Det gör det möjligt för utredaren att effektivt utföra exakta och tillförlitliga perkutana injektioner av tymuser av alla storlekar (inklusive mycket små organ som tymus hos åldrade eller immunbristmöss) med minimal stress på djuret. Denna metod möjliggör injektion av enskilda lober om så önskas och underlättar storskaliga experiment på grund av procedurens tidsbesparande natur.
Tymus har en viktig roll i T-cellutveckling och immunitet. T-cellsbrist, som bland annat kan orsakas av tymisk involution, genetiska störningar, infektioner och cancerbehandlingar, leder till hög dödlighet och sjuklighet 1,2. Musmodeller är oumbärliga i både grundläggande och translationell immunologiforskning och har använts i årtionden för att studera tymisk biologi och T-cellutveckling, samt för att utveckla behandlingar för dem som lider av tymisk dysfunktion och T-cellbrist 3,4,5.
En central del av tymiska undersökningar har varit intratymisk injektion av biologiska material som celler, gener eller proteiner i musmodeller 6,7,8,9,10,11,12. Konventionella intratymiska injektionsmetoder använder torakotomi följt av intratymisk injektion under direkt visualisering eller genom “blind” perkutan injektion i mediastinum. Det kirurgiska tillvägagångssättet ökar bland annat risken för pneumotorax avsevärt. Dessutom resulterar den förhöjda stressen under denna operation i immunsuppression, vilket potentiellt äventyrar immunologiska data13. Erfaren forskare, efter viss övning, kan utföra blindinjektionstekniken, men detta tillvägagångssätt är mindre exakt och begränsar därför experimentella ämnen till unga möss med en stor tymus.
Användningen av ultraljudsvägledning har introducerats som ett exakt och minimalt invasivt alternativ till traditionella intratymiska injektionsmetoder14. Denna procedur är dock mycket tidskrävande när du använder det integrerade järnvägssystemet istället för frihandstekniken. Att utföra injektioner med injektionsfästet kräver noggrann bildoptimering och positionering av givaren med hjälp av de olika tillbehören som givarstativet och fästet, X-, Y- och Z-positioneringssystemet, samt skicklig drift av mikromanipuleringskontrollerna och rälssystemets förlängningar. En enkel alternativ teknik, ultraljudsstyrd tymisk injektion, presenteras här utförd av en radiolog med hjälp av en frihandsmetod15, vilket är både ett snabbt och exakt minimalt invasivt alternativ till de ovan beskrivna metoderna. Det är viktigt att det nuvarande tillvägagångssättet kan utföras med alla högupplösta ultraljudsavbildningssystem utan att behöva ett injektionsfäste och integrerat skensystem. Det är särskilt användbart för studier som kräver injektion av ett stort antal möss11, för experiment som involverar injektion av båda tymiska loberna eller för korrekt injektion av små tymuser hos åldrade, bestrålade eller immunkomprometterade möss12.
En ultraljudsstyrd frihandsinjektion är en mycket exakt teknik för att leverera studiematerial till tymus på ett effektivt och aseptiskt sätt. Efter den första steriliseringen av huden på injektionsstället upprätthålls steriliteten under proceduren på grund av användning av sterila handskar, sterila ultraljudssondskydd och steril ultraljudsgel. I motsats till det blinda perkutana tillvägagångssättet 10,17 eller förlita sig på kirurgiska snitt för direkt visualisering av tymus18,19…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Raymond H. Thornton för hans insiktsfulla och omfattande tidiga arbete med denna teknik. Denna studie finansierades av bidragsstöd från National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children’s Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine och HUMC Foundation/Tackle Kids Cancer.
Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle – 12.7 mm, 30 G |
C57BL/6 mouse – aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
C57BL/6 mouse – young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |