Vi beskriver, hvordan man genererer en udbredt kirurgisk model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI) hos gnavere. Proceduren indebærer okklusion af den overlegne mesenteriske arterie efterfulgt af genoprettelse af blodgennemstrømningen. Denne model er nyttig til undersøgelser, der undersøger okklusive årsager til intestinal IRI i både veterinær- og humanmedicin.
Intestinal iskæmi-reperfusionsskade (IRI) er forbundet med et utal af tilstande inden for både veterinær- og humanmedicin. Intestinale IRI-tilstande, såsom gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion og kolik, observeres hos dyr som hunde og heste. En indledende afbrydelse af blodgennemstrømningen får væv til at blive iskæmisk. Selvom det er nødvendigt for at redde levedygtigt væv, kan efterfølgende reperfusion fremkalde yderligere skade. Den vigtigste mekanisme, der er ansvarlig for IRI, er dannelse af frie radikaler ved reperfusion og genindførelse af ilt i beskadiget væv, men der er mange andre komponenter involveret. De resulterende lokale og systemiske virkninger giver ofte en dårlig prognose.
Intestinal IRI har været genstand for omfattende forskning i løbet af de sidste 50 år. En in vivo gnavermodel, hvor basen af den overlegne mesenteriske arterie (SMA) midlertidigt ligeres, er i øjeblikket den mest almindelige metode, der anvendes til at studere intestinal IRI. Her beskriver vi en model af intestinal IRI ved hjælp af isofluranbedøvelse i 21%O2 medicinsk luft, der giver reproducerbar skade, som demonstreret ved konsekvent histopatologi af tyndtarmen. Vævsskade blev også vurderet i tyktarmen, leveren og nyrerne.
Iskæmi-reperfusionsskade (IRI) kan forekomme i ethvert organ og involverer to sekventielle komponenter. En indledende ophør af blodgennemstrømningen får berørte væv til at blive iskæmisk og derefter efterfølgende reperfusion inducerer yderligere celleskade. Skader fra reperfusionen overstiger ofte skader forårsaget af iskæmi1. IRI’s patofysiologi involverer en kompleks kaskade af begivenheder, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er dannelse af frie radikaler ved genindførelse af ilt, som forekommer under reperfusion2. Aktivering af de inflammatoriske celler og cytokiner spiller også en rolle2. I tilfælde af intestinal IRI kan bakteriel translokation i blodbanen efter endotelskader føre til systemisk inflammatorisk responssyndrom2. Hvis skaden på grund af IRI er alvorlig nok, kan resulterende systemiske virkninger føre til multiorgansvigt3.
Tilfælde af intestinal IRI er forbundet med høj sygelighed og dødelighed 4,5,6. Intestinal IRI er forbundet med mange patologiske tilstande og kirurgiske procedurer inden for både veterinær- og humanmedicin. I veterinærmedicin er dyr særligt tilbøjelige til intestinale IRI-tilstande, såsom gastrisk dilatation volvulus (GDV), mesenterisk torsion og kolik 7,8. Hos mennesker er IRI et stort og hyppigt forekommende problem ved abdominal aortaaneurismekirurgi, stranguleret brok, akut mesenterisk iskæmi, volvulus, traume, chok, neonatal nekrotiserende enterocolitis og tyndtarmsresektion eller transplantation9.
De fleste in vivo gnaverundersøgelser af intestinal IRI involverer okklusion af basen af den overlegne mesenteriske arterie (SMA), grenen af abdominal aorta, der leverer blod til størstedelen af tyndtarmen og den proksimale del af tyktarmen 10,11,12. På trods af denne models udbredte anvendelse og relative enkelhed er en detaljeret protokol, der bruger inhalationsanæstesi i 21%O2 medicinsk luft, ikke blevet offentliggjort. Manglen på en standardprotokol udgør vanskeligheder for forskere, der ikke er bekendt med proceduren og forhindrer konsistens på tværs af undersøgelser. Vi demonstrerer de nødvendige trin for at udføre den kirurgiske model af intestinal IRI i 8-14 uger gamle mandlige og kvindelige schweiziske Webster-mus. Denne model af intestinal IRI giver reproducerbar skade, som demonstreret ved konsekvent histopatologi.
På trods af den udbredte anvendelse af denne intestinale IRI-model er den ikke uden sine begrænsninger. For eksempel forhindrer eneste okklusion af bare bunden af SMA ikke blodgennemstrømningen til tarmen fuldstændigt. Dette skyldes sandsynligvis omfattende sikkerhedscirkulation i mesenteriet, som kan trække blod fra nabogrene af abdominal aorta. I en undersøgelse hos katte nedsatte SMA-okklusion blodgennemstrømningen med 35% i det proksimale tolvfingertarm, 61% i det distale tolvfingertarm, 71% i jejunum og ileum og 63% i det proksimale kolon. Blodgennemstrømningen blev ikke reduceret i den midterste og distale tyktarm, som modtager meget af deres cirkulation fra den ringere mesenteriske arterie23. Hos gnavere nævnes jejunum og ileum oftest som de tarmsegmenter, der pådrager sig den mest betydningsfulde vævsskade efter SMA-okklusion9.
En bred vifte af iskæmitider efter SMA-okklusion er blevet citeret i litteraturen, fra 1 til 90 min eller mere. Forskellige iskæmiske tider resulterer i forskellige niveauer af reperfusionsskade; Park et al. observerede reperfusionsskade, når det iskæmiske interval var mellem 40 og 60 minutter, men ikke når det iskæmiske interval var kortere eller længere24. Sådanne resultater tyder på, at kortere tider ikke producerer nok iskæmi til at tilskynde reperfusionsskade, mens længere tider beskadiger vævet så alvorligt, at det er umuligt at påvise den reperfusionsskade, der følger. Derudover medfører længere iskæmiske tider risikoen for øget dødelighed. Som det ses i vores undersøgelse, døde 50% (3/6) af de oprindelige mus, der gennemgik 60 minutters iskæmi, efter kun 90 minutters reperfusion. Forkortelse af iskæmitiden til 45 min sænkede dødeligheden til 20% (1/5) uden at ændre vævsskadescorerne. Baseret på vores undersøgelse ser det ud til, at det ideelle vindue for iskæmisk skade kan opnås ved SMA-okklusion i ca. 45 minutter.
En anden variabel er reperfusionstiden før vævsindsamling. Som med iskæmitider varierer reperfusionstiderne meget på tværs af undersøgelser, fra 60 min til over 24 timer. Flere papirer har rapporteret, at tarmslimhinden pådrager sig maksimal morfologisk skade ved 2 til 3 timers reperfusion, med fuldstændig reparation opnået ved 24 timer 25,26,27. Opsamling af væv før dette vindue på 2 til 3 timer risikerer ikke at fange det fulde omfang af reperfusionsskaden, mens væv høstet tættere på 24 timer allerede har startet reparationsprocessen. Vi valgte oprindeligt en reperfusionstid på 120 min, men skiftede derefter til 90 min i et forsøg på at sænke dødeligheden. Denne ændring ændrede ikke resultaterne af vævsskade, hvilket tyder på, at en afvigelse på 30 minutter fra vinduet på 2 til 3 timer er acceptabel.
Iltkoncentration er også en vigtig variabel i udviklingen af IRI. Wilding et al. fandt, at sammenlignet med mus, der modtog 21%O2, oplevede de, der blev bedøvet med isofluran leveret med 100%O2 , ventilationsperfusionsmismatch på grund af atelektase. I samme undersøgelse udviklede rotter, der fik 100%O2 , akut respiratorisk acidose og forhøjet gennemsnitligt arterielt tryk28. Sådanne fysiologiske ændringer undgås bedst ved inducering af en skade som IRI, hvor en række systemiske faktorer er involveret. Således synes 21%O2 at være mere passende end 100%O2 som bæregas til levering af isofluran.
Anvendelsen af heparin i denne protokol er åben for debat. Heparin er kendt for at have antikoagulative og antiinflammatoriske virkninger29. Vi fandt, at skift fra 60 min iskæmi og 120 min reperfusion til 45 min iskæmi og 90 min reperfusion med 400 IE/kg heparin ikke ændrede mikroskopisk tarmskade, men gjorde lavere dødelighed. En mulig forklaring er, at heparin forhindrede dødelig tromboemboli i fjerne organer som lunger og hjerne, men vi fandt ikke tegn på dette ved obduktion ved grov eller mikroskopisk undersøgelse af de to første mus, der døde. Brug af kortere iskæmi og reperfusionstider uden heparin kan være lige så effektiv til at reducere dødeligheden. Hvis det var tilfældet, ville det være klogt at afstå fra brugen af heparin for at minimere interferens med IRI. Imidlertid kan inkludering af heparin i protokollen være hensigtsmæssigt for dem, der ønsker at modellere kirurgiske årsager til IRI, da kirurgiske patienter ofte modtager heparin perioperativt.
Isofluran har vist sig at have vævsbeskyttende virkning i tilfælde af tarmbetændelse og iskæmi, og dets anvendelse kan interferere med en klinisk relevant IRI model 30,31,32. Imidlertid er organofluorinhalanter (dvs. isofluran, sevofluran) almindeligt anvendte anæstetika i både veterinær- og humanmedicin. Derudover overstiger længden af anæstesi, der kræves til denne protokol, 120 minutter, og derfor er et inhalationsmiddel mere passende end et korterevirkende injicerbart, som skal doseres igen.
Ingen mikroskopiske læsioner var til stede i den proksimale tyktarm, lever eller nyre. Manglen på mikroskopiske ændringer skyldtes måske den relativt korte 90 til 120 minutters reperfusionstid. Derudover har den proksimale tyktarm en blodforsyning fra den ringere mesenteriske arterie. Mangel på synlige skader udelukker dog ikke systemisk skade. Revers transkriptionskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er sandsynligvis en bedre metode til at demonstrere systemisk skade ved at måle inflammatoriske cytokiner såsom TNF-α.
Flere variationer af denne intestinale IRI-model er blevet udviklet gennem årene. I 1990 viste Megison et al., at udelukkelse af sikkerhedskar ud over SMA producerede en mere konsekvent reduktion af mesenterisk blodgennemstrømning, men en stigning i dødeligheden33. En nyere undersøgelse viste, at i stedet for at udelukke SMA ved basen, gav ligering af dets perifere og sideordnede grene for at fremkalde iskæmi i det distale ileum reproducerbar skade uden dødelighed34. Okklusion af de lokale arterielle grene sikrer maksimal iskæmi og kan løse problemet med multifokale, segmentale reduktioner af blodgennemstrømningen set med ligering af SMA lige ved dens base. Mens denne alternative metode til modellering af intestinal IRI har anvendelse til forskning i de lokale vævseffekter af intestinal IRI, er det ukendt, om det nøjagtigt kan modellere den systemiske inflammation og multiorgansvigt, som kan være forbundet med tarmskade.
SMA-okklusion er ikke en passende model for alle typer intestinal IRI. Ikke-okklusiv mesenterisk iskæmi er for eksempel karakteriseret ved splanchnisk hypoperfusion som følge af nedsat hjerteudgang. Derfor ville denne teknik ikke være optimal til at studere intestinal IRI forårsaget af myokardieinfarkt, kongestiv hjerteinsufficiens, aortainsufficiens eller nyre- eller leversygdom35. Kozar et al. rapporterede, at SMA-okklusion imidlertid er en klinisk relevant model for tarm-IRI induceret af shock36. Selvom det er mindre økonomisk, kan brugen af andre arter som svin have fordele i forhold til gnavere til modellering af visse tarmskadeforhold. En omfattende gennemgang af Gonzalez et al. i 2014 beskriver dyremodeller, der i øjeblikket er i brug til undersøgelse af intestinal IRI9.
På trods af dets begrænsninger forbliver teknikken til at okkludere SMA ved dens base en af de mest almindeligt anvendte gnavermodeller af intestinal iskæmi9. Da det kun kræver en vaskulær klemme og en grundlæggende opsætning, er selve operationen ganske enkel. Det giver også reproducerbar skade, som det fremgår af de data, der præsenteres her. SMA-okklusion hos gnavere kan pålideligt modellere okklusive årsager til intestinal IRI og kan have praktisk anvendelse i både veterinær- og humanmedicin. Derfor er det vigtigt, at de procedurer, vi har skitseret her, gennemføres konsekvent.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette projekt blev leveret af Division of Intramural Research of the National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health.
Vi vil gerne takke Dr. James Hawkins for hans mentorskab og støtte. Vi takker også Dr. Mihai Oltean og Robert Linford for deres hjælp med at lokalisere den overlegne mesenteriske arterie. Vi vil gerne takke dr. Patricia Carvalho, Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini og George Howell III for at stille deres ekspertise til rådighed under udviklingen af denne protokol. Endelig vil vi gerne takke Stephen Wincovitch for hans hjælp med at erhverve de smukke fotomikrografier, der findes i dette papir og Dr. Alicia Olivier for hendes hjælp med at mærke og gengive de endelige tal.
Adson forceps | Roboz | RS-5236 | Surgical instrument |
Alm retractor | Roboz | RS-6510 | Surgical instrument |
Anesthesia machine | Datex-Ohmeda | Aestiva 5 | |
Anesthesia: isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | Dose: 1-4%, INH |
Angiocath 20 g x 2 | Smiths Medical | 5057 | Flushing intestines with saline and formalin |
Atraumatic microvascular clip | Teleflex | 065100 | Surgical instrument |
Buffered formalin 10% | Fisher Scientific | 23-245684 | Tissue fixation |
Bupivicaine 0.25% | Hospira, Inc. | NDC 0409-1160-18 | Dose: up to 2 mg/kg drop-wise |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Dose: 1 mg/kg, SQ |
Chlorhexidine scrub 2% | Vet One | 510083 | Surgical site prep |
Circulating water blanket | Cincinnati Sub Zero | Blanketrol 2 | Body temp maintenance |
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers | Lambert Vet Supply | 008WA-41590-0438 | Surgical site prep |
Conical tubes 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | Tissue fixation and storage |
Dry ice | N/A | N/A | PCR tissue samples |
EtOH 200 proof | The Warner-Graham Company | 64-17-5 | Tissue storage |
Heparin (optional) | Meitheal Pharmaceuticals | NDC 71288-402-11 | Dose: 200-600 IU/kg |
Induction chamber | VetEquip | 941456 | |
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor | Indus Instruments | N/A | For monitoring rodent body temperature during surgery |
Isopropyl Alcohol 70% | Humco | NDC 0395-4202-28 | For scrubbing surgical site |
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL | Fisher Scientific | 05-408-121 | PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage |
Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
Nose cone | N/A | N/A | Can be homemade with syringe tube or bubble tubing |
O2 medical air 21% | Roberts Oxygen | N/A | Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume |
Ophthalmic ointment | Akorn, Inc. | NDC 17478-062-35 | Surgical prep |
PBS pH 7.4 (1x) | ThermoFisher Scientific | 10010-031 | For tissue rinsing and making 70% EtOH |
Specimen cups | Cardinal Healthcare | C13005 | For holding tissue cassettes in formalin |
Sterile Castroviejo Needle Holder | Roboz | RS-6412 | Surgical instrument |
Sterile cotton swabs | Medline | BXTA50002Z | |
Sterile gauze | Medline | PRM21423Z | |
Sterile Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5980 | Surgical instrument |
Sterile micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5693 | Surgical instrument |
Sterile micro forceps | Roboz | RS-5264 | Surgical instrument |
Sterile saline (0.9%) | Braun | R5201-01 | Must be warmed |
Sterile scalpel blade #15 | Cardinal Health (Allegiance) | 32295-015 | Surgical instrument |
Sterile scalpel handle | Roboz | RS-9843 | Surgical instrument |
Sterile surgical drape | Medline | DYNJSD1092 | |
Sterile surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
Sterile surgical stapler | Roboz | RS-9260 | Surgical instrument |
Sterile surgical staples | Roboz | RS-9262 | Abdominal skin closure |
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle | Ethicon | J212G | Closing abdominal muscle |
Surgical tape | Medline | MMM15271Z | Securing mouse in dorsal recumbancy |
Syringe 10 ml x 2 | Medline | SYR110010 | Flushing intestines with saline and formalin |
Tissue cassettes | Fisher Scientific | 22-038-665 | Rolled intestinal segments. 4 per mouse. |
Towel or drape | Medline | GEM2140 | Water blanket cover |