임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집
Summary
이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.
Abstract
최근에는 암을 비롯한 다양한 질병을 진단하기 위해 액체 생검이 사용되었습니다. 체액에는 정상 조직에서 유래한 세포, 단백질 및 핵산을 포함한 많은 물질이 포함되어 있지만 이러한 물질 중 일부는 질병 부위에서도 유래합니다. 체액에서 이러한 물질의 조사 및 분석은 다양한 질병의 진단에 중추적인 역할을 합니다. 따라서 필요한 물질을 정확하게 분리하는 것이 중요하며,이를 위해 여러 기술이 개발되었습니다.
우리는 CD-PRIME이라는 랩 온 어 디스크 유형의 장치 및 플랫폼을 개발했습니다. 이 장치는 자동화되어 있으며 시료 오염 및 시료 안정성에 대해 우수한 결과를 제공합니다. 또한 우수한 획득 수율, 짧은 작동 시간 및 높은 재현성의 장점이 있습니다. 또한, 장착할 디스크의 종류에 따라, 무세포 DNA를 포함하는 혈장, 순환 종양 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 버피 코트가 분리될 수 있다. 따라서, 체액에 존재하는 다양한 물질의 획득은 오믹스의 연구를 포함하는 다양한 다운스트림 응용을 위해 수행될 수 있다.
Introduction
암을 포함한 다양한 질병의 조기에 정확한 발견은 치료 전략 1,2,3,4를 수립하는 데 가장 중요한 요소입니다. 특히, 암의 조기 발견은 환자 5,6,7,8의 생존 기회 증가와 밀접한 관련이 있습니다. 최근에는 암의 조기 발견을 위해 액체 생검이 각광을 받고 있습니다. 고형 종양은 혈관 신생을 겪고 다양한 물질을 혈액으로 방출합니다. 특히, 암 환자의 혈액에서 순환 DNA (ctDNA), 순환 RNA (ctRNA), 단백질, 엑소 좀과 같은 소포 및 순환 종양 세포 (CTC)가 발견되었습니다 2,9. 이러한 물질의 양에는 차이가 있지만 초기 단계뿐만 아니라 후기 단계 6,10에서도 일관되게 관찰됩니다. 그러나 이러한 개인차는 매우 높습니다. 예를 들어, ctDNA를 함유하는 무세포 DNA (cfDNA)의 양은 1,000 ng 미만이고, CTC의 수는 암 환자 11,12,13의 전혈 10 mL 중 100 개 미만이다. 많은 연구에서 적은 양으로 존재하는 이러한 물질(즉, cfDNA, ctDNA 및 CTC)을 사용하여 암을 특성화했습니다. 정확한 결과를 얻으려면 고순도13,14로 소량의 물질을 정확하게 분리하는 것이 중요합니다. 종래의 원심분리 방법이 일반적으로 사용되지만 사용자의 기술에 따라 취급이 어렵고 순도가 낮습니다. CTC의 발견 이후, 원심분리 또는 밀도 등급 분리, 면역비드 및 미세유체 방법과 같은 여러 분리 기술이 개발되었습니다. CTC가 발견된 이후 몇 가지 격납 기술이 개발되었습니다. 그러나, 이들 기술은 세포를 단리하는데 사용되는 다양한 칩 및 멤브레인으로부터 세포를 단리할 필요가 있을 때 종종 제한된다(15). 또한 태깅 방식에는 FACS와 같은 장비가 필요하며, 태깅 오염으로 인해 다운스트림 공정에 한계가 있습니다.
최근에는 액체 생검의 사용이 증가하고 암의 조기 발견을위한 다양한 연구가 진행되고 있습니다. 이 방법은 간단하지만 다운 스트림 분석에는 여전히 어려움이 있으며 이러한 어려움을 극복하기 위해 다양한 연구가 시도되고 있습니다16,17. 또한 병원을 포함한 많은 현장에서는 사용하기 편리한 자동화되고 재현 가능한 고순도 분석법이 필요합니다. 여기에서 우리는 액체 생검 후 혈액 샘플에서 물질을 자동으로 분리하기 위한 랩-온-어-디스크를 개발했습니다. 이러한 장치는 원심분리, 미세유체공학 및 기공 크기의 세포 포획 원리를 기반으로 합니다. 디스크에는 세 가지 유형이 있습니다 : LBx-1은 혈장 및 버피 코트를 얻을 수 있고 LBx-2는 10mL 미만의 부피로 전혈에서 혈장 및 PBMC를 얻을 수 있습니다. FAST-auto는 디스크에서 제거 가능한 멤브레인을 사용하여 CTC를 획득 할 수도 있습니다. 한 번에 최대 4개의 디스크를 사용할 수 있습니다. 무엇보다도 이 장치 및 방법의 장점은 소량의 혈액을 이용하여 동일한 시료로부터 다양한 암 유래 물질을 얻을 수 있다는 점이다. 이것은 환자의 혈액을 한 번만 채취하면된다는 것을 의미합니다. 또한 혈액 채취 기간의 차이로 인한 오류를 배제할 수 있는 장점이 있습니다. 이 플랫폼은 사용하기 쉽고 액체 생검 및 다운스트림 응용 분야에 대한 정확한 결과를 제공합니다. 이 프로토콜에서는 장치 및 카트리지의 사용법이 소개됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
cfDNA와 CTC의 양과 농도는 암의 개인, 단계 및 유형에 따라 다릅니다. 또한 환자 2,4,5,10,20의 상태에 따라 다릅니다. 특히 암의 초기 또는 전암기에서는 암 관련 물질의 농도가 매우 낮아 검출이 불가능할 가능성이 높다. 그럼에도 불구하고 조기 발견은 환자의 생존 및 치료 전?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고는 한국의료기기개발기금(KMDF, 보조금 번호 RS-2020-KD000019)과 한국보건산업진흥원(KHIDI, 보조금 번호. HI19C0521020020)의 일부 지원을 받았다.
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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