Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas
Summary
Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.
Abstract
Recentemente, biópsias líquidas têm sido usadas para diagnosticar várias doenças, incluindo câncer. Os fluidos corporais contêm muitas substâncias, incluindo células, proteínas e ácidos nucleicos originários de tecidos normais, mas algumas dessas substâncias também se originam da área doente. A investigação e análise dessas substâncias nos fluidos corporais desempenham um papel fundamental no diagnóstico de várias doenças. Portanto, é importante separar com precisão as substâncias necessárias, e várias técnicas são desenvolvidas para serem usadas para esse fim.
Desenvolvemos um tipo de dispositivo e plataforma lab-on-a-disc chamado CD-PRIME. Este dispositivo é automatizado e tem bons resultados para contaminação da amostra e estabilidade da amostra. Além disso, tem vantagens de um bom rendimento de aquisição, um curto tempo de operação e alta reprodutibilidade. Além disso, dependendo do tipo de disco a ser montado, plasma contendo DNA livre de células, células tumorais circulantes, células mononucleares do sangue periférico ou casacos bufantes podem ser separados. Assim, a aquisição de uma variedade de materiais presentes nos fluidos corporais pode ser feita para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo o estudo da ômica.
Introduction
A detecção precoce e precisa de várias doenças, incluindo o câncer, é o fator mais importante para o estabelecimento de uma estratégia de tratamento 1,2,3,4. Em particular, a detecção precoce do câncer está intimamente relacionada ao aumento das chances de sobrevida do paciente 5,6,7,8. Recentemente, biópsias líquidas têm estado no centro das atenções para a detecção precoce do câncer. Os tumores sólidos sofrem angiogênese e liberam várias substâncias no sangue. Em particular, DNAs circulantes (ctDNAs), RNAs circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas, como exossomos, e células tumorais circulantes (CTCs) foram encontrados no sangue de pacientes com câncer 2,9. Embora existam diferenças na quantidade dessas substâncias, elas são consistentemente observadas não apenas nos estágios iniciais, mas também nos estágios posteriores 6,10. No entanto, essas diferenças individuais são muito altas; por exemplo, a quantidade de DNA livre de células (cfDNA) contendo ctDNA é inferior a 1.000 ng, e o número de CTCs é inferior a 100 em 10 mL de sangue total de pacientes com câncer11,12,13. Muitos estudos caracterizaram o câncer usando essas substâncias presentes em quantidades menores (ou seja, cfDNA, ctDNA e CTCs). Para obter resultados precisos, é importante separar com precisão pequenas quantidades de substâncias com alta pureza13,14. Os métodos convencionais de centrifugação são comumente usados, mas são difíceis de manusear e têm baixa pureza, dependendo da habilidade do usuário. Desde a descoberta das CTCs, várias técnicas de separação foram desenvolvidas, como centrifugação ou separação de grau de densidade, imunoesferas e métodos microfluídicos. Várias técnicas de contenção foram desenvolvidas desde a descoberta das CTCs. No entanto, essas técnicas são frequentemente limitadas quando é necessário isolar células dos vários cavacos e membranas utilizados para isolá-las15. Além disso, os métodos de marcação exigem equipamentos como o FACS, e há limites para o processo a jusante devido à contaminação por marcação.
Recentemente, o uso de biópsias líquidas aumentou, e vários estudos estão sendo realizados para a detecção precoce do câncer. Embora esse método seja simples, ainda existem dificuldades na análise a jusante, e vários estudos estão tentando superar essas dificuldades16,17. Além disso, muitos locais, incluindo hospitais, exigem métodos automatizados, reprodutíveis e de alta pureza que sejam convenientes de usar. Aqui, desenvolvemos um laboratório em um disco para a separação automatizada de substâncias de amostras de sangue após uma biópsia líquida. Esses dispositivos são baseados no princípio da centrifugação, microfluídica e captura de células do tamanho de poros. Existem três tipos de discos: LBx-1 pode adquirir plasma e pelagem bufante, enquanto LBx-2 pode adquirir plasma e PBMC do sangue total com um volume inferior a 10 mL; O FAST-auto também pode adquirir CTCs usando uma membrana removível do disco. Até quatro de cada disco podem ser usados em uma execução. Acima de tudo, a vantagem deste dispositivo e método é que ele pode obter uma variedade de substâncias derivadas do câncer da mesma amostra usando uma pequena quantidade de sangue. Isso significa que o sangue do paciente só precisa ser retirado uma vez. Além disso, tem a vantagem de excluir erros devido a diferenças no período de amostragem de sangue. Esta plataforma é fácil de usar e fornece resultados precisos para biópsias líquidas e aplicações a jusante. Neste protocolo, o uso do dispositivo e do cartucho é introduzido.
Protocol
Representative Results
Discussion
A quantidade e a concentração de cfDNA e CTC dependem do indivíduo, estágio e tipo de câncer. Depende também da condição do paciente 2,4,5,10,20. Em particular, nos estágios iniciais ou pré-cancerosos do câncer, as concentrações de substâncias relacionadas ao câncer são muito baixas, por isso há uma grande possibilidade de que não possa ser d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito foi apoiado em parte pelo Fundo de Desenvolvimento de Dispositivos Médicos da Coreia (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e pelo Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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