جمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في نموذج Teleost اليابانية Medaka (Oryzias latipes)
Summary
توضح هذه المقالة طريقتين سريعتين وفعالتين لجمع الحيوانات المنوية من نموذج ميداكا الأسماك الصغيرة (Oryzias latipes) ، بالإضافة إلى بروتوكول لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA).
Abstract
ميداكا اليابانية (Oryzias latipes) هي سمكة teleost ونموذج فقاري ناشئ لأبحاث السموم البيئية والتنموية والوراثية وعلم وظائف الأعضاء. يستخدم Medaka أيضا على نطاق واسع للتحقيق في تكاثر الفقاريات ، وهي وظيفة بيولوجية أساسية لأنها تسمح للأنواع بالاستمرار. جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم على خصوبة الذكور ، وبالتالي نجاح التكاثر. تقنيات استخراج الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية موثقة جيدا للعديد من الأنواع ، بما في ذلك أسماك teleost. يعد جمع الحيوانات المنوية أمرا بسيطا نسبيا في الأسماك الكبيرة ولكن يمكن أن يكون أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لذلك ، تصف هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في الأسماك النموذجية الصغيرة ، medaka اليابانية: تشريح الخصيتين وتدليك البطن. توضح هذه الورقة أن كلا النهجين ممكنان ل medaka وتظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات بشكل متكرر حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في medaka لتقييم موضوعي للعديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في medaka (الحركة ، التقدمية ، مدة الحركة ، التركيز النسبي). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.
Introduction
medaka اليابانية هي سمكة صغيرة تضع البيض في المياه العذبة موطنها شرق آسيا. أصبح Medaka نظاما نموذجيا ممتازا للفقاريات لعلم السموم البيئية ، وعلم الوراثة التنموي ، وعلم الجينوم ، ودراسات علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاءالتطوري 1,2. على غرار الزرد الشعبي ، فهي سهلة التكاثر نسبيا ومقاومة للغاية للعديد من أمراض الأسماك الشائعة 1,2. هناك العديد من المزايا لاستخدام medaka كنموذج ، بما في ذلك وقت جيل قصير ، وأجنة شفافة1،2 ، وجينوممتسلسل 3. على عكس الزرد ، يحتوي medaka على جين يحدد الجنس 4 بالإضافة إلى درجة حرارة عالية (من4-40 درجة مئوية) وتحمل الملوحة (أنواع euryhaline)5. أيضا ، تم تطوير العديد من الأدوات الوراثية والتشريحية ، بالإضافة إلى البروتوكولات6،7،8،9،10،11،12 ، في ميداكا لتسهيل دراسة بيولوجيتها.
التكاثر هو وظيفة فسيولوجية أساسية لأنه يسمح للنوع بالاستمرار. يتطلب تكاثر الفقاريات عددا لا يحصى من الأحداث المنسقة بدقة ، بما في ذلك إنتاج البويضات في الإناث وإنتاج الحيوانات المنوية في الذكور. الحيوانات المنوية هي خلايا فريدة من نوعها ، يتم إنتاجها من خلال عملية معقدة لتكوين الحيوانات المنوية ، حيث يوجد عدد من نقاط التفتيش لضمان تسليم منتج عالي الجودة13. أصبحت جودة الأمشاج محط تركيز في دراسات تربية الأحياء المائية وأعداد الأسماك نظرا لتأثيرها على نجاح الإخصاب وبقاء اليرقات. وبالتالي ، فإن جودة الحيوانات المنوية هي مؤشر مهم لخصوبة الذكور في الفقاريات.
ثلاثة عوامل مفيدة لتقييم جودة الحيوانات المنوية للأسماك هي الحركة والتقدمية وطول العمر. تعد النسبة المئوية للحركة والحركة التقدمية من المؤشرات الشائعة لجودة الحيوانات المنوية حيث أن الحركة التقدمية ضرورية وترتبط ارتباطا وثيقا بنجاح الإخصاب14,15. تعد مدة الحركة أيضا مؤشرا مهما في الأسماك حيث تظل الحيوانات المنوية متحركة بالكامل لمدة تقل عن 2 دقيقة في معظم أنواع teleost ويكون مسار الحيوانات المنوية بشكل عام أقل خطية من الثدييات15. ومع ذلك ، اعتمدت العديد من الدراسات التي تقيم حركة الحيوانات المنوية في الماضي على طرق ذاتية أو شبه كمية لتحليل الحيوانات المنوية15,16. على سبيل المثال ، تم تقدير حركة الحيوانات المنوية في medaka في الماضي بصريا تحت المجهر17. كما تم تقديره من خلال تسجيل حركة الحيوانات المنوية واستخدام برامج التصوير لدمج الإطارات وقياس مسار السباحة وسرعتها18،19،20. غالبا ما تفتقر هذه الأساليب إلى المتانة ، حيث تقدم نتائج مختلفة وفقا للشخص الذي يقوم بإجراء التحليل15,21.
تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA) في البداية للثدييات. CASA هي طريقة كمية سريعة لتقييم جودة الحيوانات المنوية عن طريق تسجيل وقياس السرعة والمسار بطريقة آلية15. في الأسماك ، تم استخدامه في أنواع مختلفة لرصد آثار العديد من ملوثات المياه على جودة الحيوانات المنوية ، لتحديد السلف المثيرة للاهتمام لتحسين الأمهات ، لتحسين كفاءة الحفظ بالتبريد والتخزين ، وتحسين ظروف الإخصاب15. لذلك ، فهي أداة قوية لتقييم جودة الحيوانات المنوية بشكل موثوق في أنواع الفقاريات المختلفة. ومع ذلك ، نظرا للتنوع المهم في استراتيجيات التكاثر بين الأسماك ، فإن الحيوانات المنوية لأسماك teleost تختلف عن تلك الموجودة في الثدييات ومن نوع سمكي إلى آخر. تحتوي أسماك Teleost ، التي تخصب البيض خارجيا بشكل أساسي عن طريق إطلاق الأمشاج في الماء ، على منوية عالية التركيز بسيطة نسبيا في التركيب بدون جسيم ، على عكس الثدييات ، التي تخصب داخليا وبالتالي لا يتعين عليها تعويض التخفيف في الماء ، ولكن عليها تحمل المزيد من السوائل اللزجة14. بالإضافة إلى ذلك ، تتحرك الحيوانات المنوية من معظم الأسماك بسرعة ولكنها متحركة بالكامل لمدة تقل عن دقيقتين بعد التنشيط ، على الرغم من وجود العديد من الاستثناءات15,22. نظرا لأن الحركة يمكن أن تنخفض بسرعة في معظم الأسماك ، يجب توخي الحذر الشديد مع توقيت التحليل بعد التنشيط عند تحديد بروتوكول تحليل الحيوانات المنوية للأسماك.
التكاثر هو أحد المجالات في علم الأحياء التي تم فيها استخدام teleosts و medaka على نطاق واسع ككائنات نموذجية. في الواقع ، يظهر ذكور medaka سلوكيات إنجابية واجتماعية مثيرة للاهتمام ، مثل حراسة الشريك23,24. بالإضافة إلى ذلك ، توجد العديد من الخطوط المعدلة وراثيا لدراسة التحكم في الغدد الصم العصبية للتكاثر في هذا النوع25،26،27. يمكن أن يكون أخذ عينات من الحيوانات المنوية ، وهو إجراء بسيط نسبيا في الأسماك الكبيرة ، أكثر تعقيدا في الأسماك النموذجية الصغيرة لأنها تنتج منوية أقل وأكثر حساسية. لهذا السبب ، فإن معظم الدراسات التي تنطوي على أخذ عينات من الحيوانات المنوية في medaka استخراج milt (السائل المنوي للأسماك) عن طريق سحق الخصيتين تشريح17،28،29،30. تستخدم بعض الدراسات أيضا تدليكا معدلا للبطن للتعبير عن الذوبان مباشرة في الوسط المنشط18،19،20 ؛ ومع ذلك ، مع هذه الطريقة ، من الصعب تصور كمية ولون الذوبان المستخرج. في الزرد ، يستخدم تدليك البطن بشكل شائع للتعبير عن الميل ، والذي يتم جمعه على الفور في أنبوب شعري31،32،33. تتيح هذه الطريقة تقدير حجم الذوبان ، وكذلك مراقبة لون القذف ، وهو مؤشر سريع وبسيط لجودة الحيوانات المنوية32,33. لذلك ، لا يوجد بروتوكول واضح وموضح جيدا لجمع الحيوانات المنوية وتحليلها في medaka.
لذلك توضح هذه المقالة طريقتين لجمع الحيوانات المنوية في نموذج صغير للأسماك اليابانية medaka: تشريح الخصيتين وتدليك البطن بأنابيب شعرية. يوضح أن كلا النهجين ممكنان ل medaka ويظهر أنه يمكن إجراء تدليك البطن عدة مرات متكررة حيث تتعافى الأسماك بسرعة من الإجراء. كما يصف بروتوكولا لتحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر في ميداكا لقياس العديد من المؤشرات المهمة لجودة الحيوانات المنوية في ميداكا (الحركة ، والتقدم ، وطول العمر ، والتركيز النسبي للحيوانات المنوية). هذه الإجراءات ، المحددة لهذا النموذج الصغير المفيد ، ستعزز بشكل كبير فهم العوامل البيئية والفسيولوجية والوراثية التي تؤثر على الخصوبة لدى ذكور الفقاريات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسمولية هي عامل مهم في تنشيط الحيوانات المنوية للأسماك36,37. بشكل عام ، تكون الحيوانات المنوية غير متحركة في الخصيتين وتصبح متحركة في الوسائط التي تكون مفرطة التناضح بالنسبة للسائل المنوي للأسماك البحرية ، وناقصة التناضح بالنسبة للسائل المنوي لأسماك المي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل الجامعة النرويجية لعلوم الحياة وبرنامج فولبرايت الأمريكي. يود المؤلفون أن يشكروا أنتوني بلتيير ولورد كاريون جي تان في NMBU على صيانة مرافق الأسماك وغيوم جورميلين من ISC LPGP في INRAE (فرنسا) لتوفير الأسماك ومساحة المختبر لمزيد من اختبار هذه الأساليب.
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
Riferimenti
- Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
- Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
- Wiley-Blackwell. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , (2019).
- Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
- Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
- vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
- Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
- Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
- Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
- Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
- Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
- Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
- Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
- Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
- Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
- Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
- Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
- Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
- Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
- Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
- Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
- Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
- Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
- Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
- Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
- Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
- Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
- Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
- Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
- Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
- Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
- Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
- Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).
