Spermaverzameling en computerondersteunde spermaanalyse in het Teleost-model Japanse Medaka (Oryzias latipes)
Summary
Dit artikel beschrijft twee snelle en efficiënte methoden voor het verzamelen van sperma van het kleine modelvis medaka (Oryzias latipes), evenals een protocol voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA).
Abstract
Japanse medaka (Oryzias latipes) is een teleostvis en een opkomend gewerveld model voor ecotoxicologie, ontwikkelings-, genetica- en fysiologieonderzoek. Medaka wordt ook op grote schaal gebruikt om de voortplanting van gewervelde dieren te onderzoeken, wat een essentiële biologische functie is omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. De kwaliteit van het sperma is een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid en dus het succes van de voortplanting. Technieken voor het extraheren van sperma- en spermaanalyse zijn goed gedocumenteerd voor veel soorten, waaronder teleostvissen. Het verzamelen van sperma is relatief eenvoudig in grotere vissen, maar kan ingewikkelder zijn in kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Dit artikel beschrijft daarom twee methoden voor het verzamelen van sperma in de kleine modelvis, Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage. Dit artikel toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vissen snel herstellen van de procedure. Dit artikel beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om objectief verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te beoordelen (motiliteit, progressiviteit, duur van motiliteit, relatieve concentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.
Introduction
Japanse medaka is een kleine, eierleggende zoetwater teleost vis afkomstig uit Oost-Azië. Medaka is een uitstekend modelsysteem voor gewervelde dieren geworden voor ecotoxicologie, ontwikkelingsgenetica, genomica en evolutionaire biologie en fysiologiestudies 1,2. Net als de populaire zebravissen zijn ze relatief gemakkelijk te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende visziekten 1,2. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als model, waaronder een korte generatietijd, transparante embryo’s 1,2 en een gesequenced genoom3. In tegenstelling tot zebravissen heeft medaka een geslachtsbepalend gen4 en een hoge temperatuur (van 4-40 °C) en zoutgehalte (euryhaliene soort) tolerantie5. Ook zijn veel genetische en anatomische hulpmiddelen, evenals protocollen 6,7,8,9,10,11,12, ontwikkeld in medaka om de studie van de biologie te vergemakkelijken.
Voortplanting is een essentiële fysiologische functie omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. Gewervelde reproductie vereist een groot aantal nauwkeurig georkestreerde gebeurtenissen, waaronder de productie van eicellen bij vrouwen en de productie van sperma bij mannen. Sperma zijn unieke cellen, geproduceerd door het complexe proces van spermatogenese, waarbij er een aantal controlepunten zijn om de levering van een hoogwaardig product te garanderen13. Gametenkwaliteit is een focus geworden in aquacultuur- en vispopulatiestudies vanwege de impact op het succes van de bevruchting en de overleving van larven. De kwaliteit van het sperma is daarom een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid bij gewervelde dieren.
Drie nuttige factoren voor het beoordelen van de kwaliteit van het sperma van vissen zijn beweeglijkheid, progressiviteit en levensduur. Procentuele beweeglijkheid en progressieve beweeglijkheid zijn veel voorkomende indicatoren van de spermakwaliteit, omdat progressieve beweging noodzakelijk is voor en sterk correleert met bevruchtingssucces14,15. De duur van de beweging is ook een belangrijke indicator bij vissen, omdat sperma bij de meeste teleostsoorten minder dan 2 minuten volledig beweeglijk blijft en het traject van sperma over het algemeen minder lineair is dan bij zoogdieren15. Veel studies die de beweeglijkheid van sperma in het verleden beoordeelden, vertrouwden echter op subjectieve of semi-kwantitatieve methoden voor het analyseren van sperma15,16. De beweeglijkheid van het sperma in medaka is bijvoorbeeld in het verleden visueel geschat onder een microscoop17. Het is ook geschat door spermabewegingen te registreren en beeldvormingssoftware te gebruiken om frames samen te voegen en zwempad en -snelheid te meten 18,19,20. Dergelijke benaderingen missen vaak robuustheid en leveren verschillende resultaten op volgens de persoon die de analyse uitvoert15,21.
Computer-assisted sperm analysis (CASA) werd in eerste instantie ontwikkeld voor zoogdieren. CASA is een snelle kwantitatieve methode om de spermakwaliteit te beoordelen door de snelheid en het traject op een geautomatiseerde manier te registreren en te meten15. Bij vissen is het in verschillende soorten gebruikt om de effecten van verschillende waterverontreinigende stoffen op de spermakwaliteit te monitoren, voor het identificeren van interessante voorlopers om het broedbestand te verbeteren, om de efficiëntie van cryopreservatie en opslag te verbeteren en om de omstandigheden voor bevruchting te optimaliseren15. Daarom is het een krachtig hulpmiddel voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit bij verschillende gewervelde soorten. Vanwege de belangrijke diversiteit in voortplantingsstrategieën tussen vissen, verschilt het sperma van teleostvissen echter van dat van zoogdieren en van de ene vissoort tot de andere. Teleostvissen, die voornamelijk eieren extern bevruchten door gameten in water vrij te geven, hebben sterk geconcentreerd sperma dat relatief eenvoudig van structuur is zonder acrosoom, in tegenstelling tot zoogdieren, die intern bevruchten en daarom niet hoeven te compenseren voor verdunning in water, maar wel meer viskeuze vloeistoffen moeten weerstaan14. Bovendien beweegt sperma van de meeste vissen snel, maar is het minder dan 2 minuten na activering volledig beweeglijk, hoewel er verschillende uitzonderingen zijn15,22. Omdat de beweeglijkheid bij de meeste vissen snel kan afnemen, moet uiterste voorzichtigheid worden betracht met de timing van de analyse na activering bij het bepalen van een spermaanalyseprotocol voor vissen.
Reproductie is een van de gebieden in de biologie waarin teleosts en medaka op grote schaal zijn gebruikt als modelorganismen. Inderdaad, medaka-mannetjes vertonen interessant reproductief en sociaal gedrag, zoals partnerbewakingvan 23,24. Daarnaast bestaan er verschillende transgene lijnen om de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij deze soort te bestuderen 25,26,27. Spermabemonstering, een procedure die relatief eenvoudig is bij grotere vissen, kan ingewikkelder zijn bij kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Om deze reden, de meeste studies met sperma bemonstering in medaka extract milt (vis sperma) door het verpletteren van ontleed teelballen 17,28,29,30. Een paar studies gebruiken ook een gemodificeerde buikmassage om de milt direct uit te drukken in activerend medium 18,19,20; met deze methode is het echter moeilijk om de hoeveelheid en kleur van milt geëxtraheerd te visualiseren. Bij zebravissen wordt buikmassage vaak gebruikt om milt uit te drukken, dat onmiddellijk wordt verzameld in een capillaire buis 31,32,33. Deze methode maakt het mogelijk om het volume milt te schatten, evenals observatie van de ejaculaatkleur, wat een snelle en eenvoudige indicator is van de spermakwaliteit32,33. Daarom ontbreekt een duidelijk en goed beschreven protocol voor spermaverzameling en -analyse voor medaka.
Dit artikel beschrijft daarom twee methoden van spermaverzameling in de kleine modelvis Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage met capillaire buisjes. Het toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vis snel herstelt van de procedure. Het beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om op betrouwbare wijze verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te meten (beweeglijkheid, progressiviteit, levensduur en relatieve spermaconcentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osmolaliteit is een belangrijke factor bij de activering van vissperma36,37. Over het algemeen zijn sperma immotielen in de teelballen en worden ze beweeglijk in media die hyperosmotisch zijn ten opzichte van zaadvloeistof voor zeevissen, en hypo-osmotisch ten opzichte van zaadvloeistof voor zoetwatervissen37. Net als bloed is zaadplasma in zoetwatervissen doorgaans lager dan dat van zeevissen (ongeveer 300 mOsmol/kg vergeleken met 400 mOs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is gefinancierd door de Noorse University of Life Sciences en het Amerikaanse Fulbright-programma. De auteurs willen Anthony Peltier en Lourdes Carreon G Tan van NMBU bedanken voor het onderhoud van visfaciliteiten en Guillaume Gourmelin van de ISC LPGP bij INRAE (Frankrijk) voor het bieden van vis- en laboratoriumruimte om deze methoden verder te testen.
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
Riferimenti
- Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
- Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
- Wiley-Blackwell. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , (2019).
- Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
- Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
- vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
- Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
- Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
- Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
- Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
- Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
- Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
- Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
- Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
- Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
- Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
- Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
- Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
- Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
- Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
- Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
- Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
- Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
- Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
- Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
- Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
- Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
- Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
- Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
- Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
- Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
- Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
- Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).
