Spermienentnahme und computergestützte Spermienanalyse im Teleostmodell Japanisches Medaka (Oryzias latipes)
Summary
Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und effiziente Methoden zur Entnahme von Spermien aus dem kleinen Modellfisch Medaka (Oryzias latipes) sowie ein Protokoll zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA).
Abstract
Der Japanische Medaka (Oryzias latipes) ist ein Teleostfisch und ein aufstrebendes Wirbeltiermodell für Ökotoxikologie, Entwicklungs-, Genetik- und Physiologieforschung. Medaka wird auch ausgiebig verwendet, um die Fortpflanzung von Wirbeltieren zu untersuchen, was eine wesentliche biologische Funktion ist, da sie es einer Art ermöglicht, sich zu verewigen. Die Spermienqualität ist ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit und damit für den Fortpflanzungserfolg. Techniken zur Extraktion von Spermien und Spermienanalysen sind für viele Arten, einschließlich Teleostfische, gut dokumentiert. Das Sammeln von Spermien ist bei größeren Fischen relativ einfach, kann aber bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermienentnahme beim kleinen Modellfisch, der japanischen Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage. Diese Arbeit zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich die Fische schnell von dem Eingriff erholen. Dieser Artikel beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität objektiv zu bewerten (Motilität, Progressivität, Dauer der Motilität, relative Konzentration). Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.
Introduction
Japanischer Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasser-Teleostfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Medaka hat sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodellsystem für Ökotoxikologie, Entwicklungsgenetik, Genomik und evolutionäre Biologie und Physiologie entwickelt 1,2. Ähnlich wie der beliebte Zebrafisch sind sie relativ einfach zu züchten und sehr resistent gegen viele häufige Fischkrankheiten 1,2. Die Verwendung von Medaka als Modell bietet mehrere Vorteile, darunter eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen 1,2 und ein sequenziertes Genom3. Im Gegensatz zu Zebrafischen hat Medaka ein geschlechtsbestimmendes Gen 4 sowie eine hohe Temperatur- (von4-40 °C) und Salzgehaltstoleranz (Euryhaline-Arten)5. Auch viele genetische und anatomische Werkzeuge sowie die Protokolle 6,7,8,9,10,11,12 wurden in Medaka entwickelt, um das Studium seiner Biologie zu erleichtern.
Fortpflanzung ist eine wesentliche physiologische Funktion, da sie es einer Spezies ermöglicht, sich zu verewigen. Die Fortpflanzung von Wirbeltieren erfordert eine Vielzahl von genau orchestrierten Ereignissen, einschließlich der Produktion von Eizellen bei Frauen und der Produktion von Spermien bei Männern. Spermien sind einzigartige Zellen, die durch den komplexen Prozess der Spermatogenese hergestellt werden, in denen es eine Reihe von Kontrollpunkten gibt, um die Lieferung eines hochwertigen Produkts zu gewährleisten13. Die Gametenqualität ist aufgrund ihrer Auswirkungen auf den Befruchtungserfolg und das Überleben der Larven zu einem Schwerpunkt in Aquakultur- und Fischpopulationsstudien geworden. Die Spermienqualität ist daher ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit bei Wirbeltieren.
Drei nützliche Faktoren zur Beurteilung der Qualität von Fischspermien sind Motilität, Progressivität und Langlebigkeit. Prozentuale Motilität und progressive Motilität sind häufige Indikatoren für die Spermienqualität, da progressive Bewegung notwendig ist und stark mit dem Befruchtungserfolg korreliert14,15. Die Dauer der Bewegung ist auch ein wichtiger Indikator bei Fischen, da die Spermien bei den meisten Teleostarten weniger als 2 Minuten lang voll beweglich bleiben und die Flugbahn der Spermien im Allgemeinen weniger linear ist als bei Säugetieren15. Viele Studien, die die Spermienmotilität in der Vergangenheit bewerteten, stützten sich jedoch auf subjektive oder semiquantitative Methoden zur Analyse von Spermien15,16. Zum Beispiel wurde die Spermienmotilität in Medaka in der Vergangenheit visuell unter einem Mikroskop geschätzt17. Es wurde auch geschätzt, indem die Bewegung der Spermien aufgezeichnet und Bildgebungssoftware verwendet wurde, um Rahmen zusammenzuführen und den Schwimmweg und die Geschwindigkeit zu messen18,19,20. Solchen Ansätzen mangelt es oft an Robustheit und liefert je nach Person, die die Analyse durchführt, unterschiedliche Ergebnisse15,21.
Die computergestützte Spermienanalyse (CASA) wurde ursprünglich für Säugetiere entwickelt. CASA ist eine schnelle quantitative Methode zur Beurteilung der Spermienqualität durch automatisierte Aufzeichnung und Messung von Geschwindigkeit und Flugbahn15. Bei Fischen wurde es bei verschiedenen Arten eingesetzt, um die Auswirkungen mehrerer Wasserschadstoffe auf die Spermienqualität zu überwachen, interessante Vorläufer zur Verbesserung des Brutbestands zu identifizieren, die Effizienz der Kryokonservierung und -lagerung zu verbessern und die Bedingungen für die Befruchtung zu optimieren15. Daher ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität bei verschiedenen Wirbeltierarten. Aufgrund der großen Vielfalt der Fortpflanzungsstrategien zwischen den Fischen unterscheidet sich das Sperma von Teleostfischen jedoch von dem von Säugetieren und von einer Fischart zur anderen. Teleostfische, die Eier hauptsächlich äußerlich befruchten, indem sie Gameten ins Wasser abgeben, haben hochkonzentrierte Spermien, die relativ einfach in der Struktur ohne Akrosom sind, im Gegensatz zu Säugetieren, die intern düngen und daher die Verdünnung in Wasser nicht kompensieren müssen, sondern viskoseren Flüssigkeiten standhaltenmüssen 14. Darüber hinaus bewegen sich die Spermien der meisten Fische schnell, sind aber für weniger als 2 Minuten nach der Aktivierung vollständig beweglich, obwohl es mehrere Ausnahmengibt 15,22. Da die Motilität bei den meisten Fischen schnell abnehmen kann, sollte bei der Festlegung eines Spermienanalyseprotokolls für Fische äußerste Vorsicht beim Zeitpunkt der Analyse nach der Aktivierung geboten sein.
Die Fortpflanzung ist eines der Gebiete in der Biologie, in denen Teleosts und Medaka ausgiebig als Modellorganismen eingesetzt wurden. In der Tat zeigen Medaka-Männchen interessante reproduktive und soziale Verhaltensweisen, wie z.B. Mate Guarding23,24. Darüber hinaus existieren mehrere transgene Linien, um die neuroendokrine Kontrolle der Fortpflanzung bei dieser Spezieszu untersuchen 25,26,27. Die Spermienprobenahme, ein Verfahren, das bei größeren Fischen relativ einfach ist, kann bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Aus diesem Grund extrahieren die meisten Studien mit Spermienentnahme in Medaka Milz (Fischsamen) durch Zerkleinern von sezierten Hoden 17,28,29,30. Einige Studien verwenden auch eine modifizierte Bauchmassage, um die Milz direkt in das aktivierende Medium18,19,20 auszudrücken; Mit dieser Methode ist es jedoch schwierig, die Menge und Farbe der extrahierten Milz zu visualisieren. Bei Zebrafischen wird die Bauchmassage häufig verwendet, um Milz auszudrücken, die sofort in einem Kapillarrohr31,32,33 gesammelt wird. Diese Methode ermöglicht die Abschätzung des Milzvolumens sowie die Beobachtung der Ejakulatfarbe, die ein schneller und einfacher Indikator für die Spermienqualitätist 32,33. Daher fehlt für Medaka ein klares und gut beschriebenes Protokoll für die Spermienentnahme und -analyse.
Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermiengewinnung im kleinen Modellfisch Japanese Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage mit Kapillarschläuchen. Es zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich der Fisch schnell von dem Eingriff erholt. Es beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität (Motilität, Progressivität, Langlebigkeit und relative Spermienkonzentration) zuverlässig zu messen. Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osmolalität ist ein wichtiger Faktor bei der Aktivierung von Fischspermien36,37. Im Allgemeinen sind Spermien in den Hoden unbeweglich und werden beweglich in Medien, die im Verhältnis zur Samenflüssigkeit für Meeresfische hyperosmotisch und bei Süßwasserfischen hypoosmotisch relativ zur Samenflüssigkeit sind37. Ähnlich wie Blut ist das Samenplasma bei Süßwasserfischen typischerweise niedriger als bei Meeresfischen (etwa 300 mOsm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Norwegian University of Life Sciences und dem US-amerikanischen Fulbright-Programm finanziert. Die Autoren danken Anthony Peltier und Lourdes Carreon G Tan von NMBU für die Wartung von Fischanlagen und Guillaume Gourmelin vom ISC LPGP am INRAE (Frankreich) für die Bereitstellung von Fisch- und Laborräumen, um diese Methoden weiter zu testen.
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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