איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Summary

מאמר זה מתאר שתי שיטות מהירות ויעילות לאיסוף זרע מדאקה דג מודל קטן (Oryzias latipes), כמו גם פרוטוקול להערכה אמינה של איכות הזרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA).

Abstract

מדאקה יפנית (Oryzias latipes) היא דג טלוסט ומודל מתפתח של בעלי חוליות למחקר אקוטוקסיקולוגיה, התפתחות, גנטיקה ופיזיולוגיה. מדאקה משמשת באופן נרחב גם כדי לחקור רבייה של בעלי חוליות, שהיא פונקציה ביולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. איכות הזרע היא אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר, ובכך להצלחת הרבייה. טכניקות להפקת זרע וניתוח זרע מתועדות היטב עבור מינים רבים, כולל דגי טלוסט. איסוף זרע הוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, אך יכול להיות מסובך יותר בדגים קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מאמר זה, אם כן, מתאר שתי שיטות לאיסוף זרע בדג המודל הקטן, מדאקה יפנית: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן. מאמר זה מדגים כי שתי הגישות אפשריות עבור medaka ומראה כי עיסוי בטן יכול להתבצע מספר חוזר של פעמים כאשר הדגים מתאוששים במהירות מההליך. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול לניתוח זרע בעזרת מחשב במדאקה כדי להעריך באופן אובייקטיבי מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, משך תנועתיות, ריכוז יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

Introduction

מדאקה יפנית היא דג טלוסט קטן המטיל ביצים במים מתוקים שמקורו במזרח אסיה. מדאקה הפכה למערכת מודל מצוינת של בעלי חוליות עבור אקוטוקסיקולוגיה, גנטיקה התפתחותית, גנומיקה, ביולוגיה אבולוציונית ומחקרי פיזיולוגיה ^1,2. בדומה לדגי הזברה הפופולריים, הם קלים יחסית לגידול ועמידים מאוד למחלות דגים נפוצות רבות ^1,2. ישנם מספר יתרונות לשימוש במדאקה כמודל, כולל זמן דור קצר, עוברים שקופים ^1,2 וגנום מרוצף³. שלא כמו דגי זברה, למדאקה יש גן הקובע את המין⁴ וכן טמפרטורה גבוהה (בין 4-40 מעלות צלזיוס) וסבילות מליחות (מינים אוריהלינים)⁵. כמו כן, כלים גנטיים ואנטומיים רבים, כמו גם פרוטוקולים 6,7,8,9,10,11,12^, פותחו במדאקה כדי להקל על חקר הביולוגיה שלה.

רבייה היא פונקציה פיזיולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. רבייה של בעלי חוליות דורשת מספר עצום של אירועים מתוזמרים במדויק, כולל ייצור ביציות אצל נקבות וייצור זרע אצל זכרים. זרע הם תאים ייחודיים, המיוצרים בתהליך מורכב של זרעונים, שבו ישנם מספר מחסומים במקום כדי להבטיח אספקה של מוצר באיכות גבוהה¹³. איכות הגמטה הפכה למוקד בחקלאות ימית ובחקר אוכלוסיות דגים בשל השפעתה על הצלחת ההפריה והישרדות הזחלים. איכות הזרע היא, אם כן, אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר אצל בעלי חוליות.

שלושה גורמים שימושיים להערכת איכות זרע הדגים הם תנועתיות, התקדמות ואריכות ימים. תנועתיות באחוזים ותנועתיות פרוגרסיבית הם אינדיקטורים נפוצים לאיכות הזרע שכן תנועה פרוגרסיבית נחוצה ומתואמת מאוד עם הצלחת ההפריה^14,15. משך התנועה הוא גם אינדיקטור חשוב בדגים שכן הזרע נשאר תנועתי באופן מלא במשך פחות מ -2 דקות ברוב מיני הטלוסט ומסלול הזרע הוא בדרך כלל פחות ליניארי מאשר ביונקים¹⁵. עם זאת, מחקרים רבים שהעריכו את תנועתיות הזרע בעבר הסתמכו על שיטות סובייקטיביות או כמותיות למחצה לניתוח זרע^15,16. לדוגמה, תנועתיות הזרע במדאקה הוערכה בעבר באופן חזותי תחת מיקרוסקופ¹⁷. כמו כן, הוא הוערך על ידי רישום תנועת זרע ושימוש בתוכנת הדמיה למיזוג מסגרות ומדידת נתיב שחייה ומהירות^18,19,20. גישות כאלה לעתים קרובות חסרות חוסן, ומספקות תוצאות שונות בהתאם לאדם המבצע את הניתוח ^15,21.

ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA) פותח בתחילה עבור יונקים. CASA היא שיטה כמותית מהירה להערכת איכות הזרע על ידי הקלטה ומדידה של מהירות ומסלול באופן אוטומטי¹⁵. בדגים, הוא שימש במינים שונים כדי לפקח על ההשפעות של כמה מזהמי מים על איכות הזרע, לזיהוי אבות מעניינים כדי לשפר broodstock, כדי לשפר את היעילות של שימור בהקפאה ואחסון, כדי לייעל את התנאים להפריה¹⁵. לכן, זהו כלי רב עוצמה להערכה אמינה של איכות הזרע במינים שונים של בעלי חוליות. עם זאת, בשל המגוון החשוב באסטרטגיות הרבייה בין דגים, הזרע של דגי הטלוסט שונה מזה של יונקים וממין דג אחד למשנהו. לדגי טלוסט, המפרים בעיקר ביציות חיצונית על ידי שחרור גמטות למים, יש זרע מרוכז מאוד שהוא פשוט יחסית במבנה ללא אקרוזום, בניגוד ליונקים, אשר מפרים פנימית ולכן אינם צריכים לפצות על דילול במים, אך כן צריכים לעמוד בנוזלים צמיגים יותר¹⁴. בנוסף, זרע מרוב הדגים נע במהירות אך הוא תנועתי לחלוטין במשך פחות מ -2 דקות לאחר ההפעלה, אם כי ישנם מספר יוצאים מן הכלל^15,22. מכיוון שהתנועתיות יכולה לרדת במהירות אצל רוב הדגים, יש לנקוט בזהירות רבה עם תזמון הניתוח לאחר ההפעלה בעת קביעת פרוטוקול ניתוח זרע לדגים.

רבייה היא אחד התחומים בביולוגיה שבהם טלאוסטים ומדאקה שימשו באופן נרחב כאורגניזמי מודל. ואכן, זכרי מדאקה מראים התנהגויות רבייה וחברתיות מעניינות, כגון שמירה על^{הזדווגות 23,24.} בנוסף, קיימים מספר קווים מהונדסים כדי לחקור את השליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה במין זה^25,26,27. דגימת זרע, הליך שהוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, יכולה להיות מסובכת יותר בדגי מודל קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מסיבה זו, רוב המחקרים הכוללים דגימת זרע בתמצית medaka milt (זרע דגים) על ידי ריסוק אשכים מנותחים 17,28,29,30. כמה מחקרים משתמשים גם בעיסוי בטן שונה כדי לבטא את המילט ישירות להפעלת^{מדיום 18,19,20}; עם זאת, בשיטה זו קשה לדמיין את כמות וצבע של Milt שחולץ. אצל דגי זברה, עיסוי בטן משמש בדרך כלל כדי להביע milt, אשר נאסף מיד בצינור נימי^31,32,33. שיטה זו מאפשרת להעריך את נפח המילט, כמו גם תצפית על צבע השפיכה, המהווה אינדיקטור מהיר ופשוט לאיכות הזרע^32,33. לכן, פרוטוקול ברור ומתואר היטב לאיסוף וניתוח זרע חסר למדקה.

מאמר זה מתאר אפוא שתי שיטות לאיסוף זרע בדגם הקטן של דג מדאקה יפני: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן עם צינורות נימיים. הוא מדגים כי שתי הגישות אפשריות למדאקה ומראה כי ניתן לבצע עיסוי בטן מספר חוזר ונשנה של פעמים כאשר הדג מתאושש במהירות מההליך. הוא גם מתאר פרוטוקול לניתוח זרע בסיוע מחשב במדאקה כדי למדוד באופן מהימן מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, אריכות ימים וריכוז זרע יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

Protocol

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי חיים ניסיוניים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים (NMBU). הניסויים בוצעו באמצעות זכרי מדאקה (זן Hd-rR) זכרים בוגרים (בני 6-9 חודשים) שגודלו ב-NMBU (Ås, נורבגיה). השיטות נבדקו לזמן קצר גם במדאקה יפנית זכרית בת 9 חודשים (זן CAB) שגדלה במכון המח…

Representative Results

סוג הנתונים שהתקבלוניתוח תנועתיות זרע מתוכנת SCA Evolution מספק נתונים על תנועתיות (אחוז הזרע התנועתי והלא תנועתי), כמו גם על התקדמות (אחוז הזרע המתקדם והלא פרוגרסיבי), ומהירות (אחוז הזרע המהיר, הבינוני והאיטי). הוא גם משלב התקדמות ומהירות (פרוגרסיבי מהיר, פרוגרסיבי בינוני, לא פרוגרסיב…

Discussion

אוסמולליות היא גורם חשוב בהפעלת זרע דגים^36,37. באופן כללי, זרעונים הם תנועתיים באשכים והופכים תנועתיים במדיה שהיא היפרוסמוטית ביחס לנוזל הזרע עבור דגים ימיים, והיפו-אוסמוטי ביחס לנוזל הזרע עבור דגי מים מתוקים³⁷. בדומה לדם, פלזמת הזרע בדגי מים מתוק…

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040