Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)
Summary
이 기사에서는 작은 모델 물고기 medaka (Oryzias latipes)에서 정자를 수집하는 두 가지 빠르고 효율적인 방법과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)을 사용하여 정자의 질을 안정적으로 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
일본 medaka (Oryzias latipes)는 teleost 물고기이며 생태 독성학, 발달, 유전학 및 생리학 연구를위한 새로운 척추 동물 모델입니다. Medaka는 또한 종이 영속할 수 있도록 하는 필수적인 생물학적 기능인 척추동물 번식을 조사하는 데 광범위하게 사용됩니다. 정자의 질은 남성의 생식력과 번식 성공의 중요한 지표입니다. 정자 추출 및 정자 분석 기술은 teleost 물고기를 포함한 많은 종에 대해 잘 문서화되어 있습니다. 정자 수집은 큰 물고기에서는 비교적 간단하지만 작은 모델 물고기에서는 정자를 덜 생산하고 더 섬세하기 때문에 더 복잡 할 수 있습니다. 따라서이 기사에서는 작은 모델 물고기 인 일본 메다 카에서 정자 수집의 두 가지 방법, 즉 고환 해부와 복부 마사지에 대해 설명합니다. 이 논문은 두 가지 접근법 모두 medaka에 대해 실현 가능하다는 것을 보여 주며 물고기가 절차에서 빠르게 회복됨에 따라 복부 마사지를 반복적으로 수행 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기사는 또한 medaka 정자 품질 (운동성, 진행성, 운동성 지속 기간, 상대 농도)의 몇 가지 중요한 지표를 객관적으로 평가하기 위해 medaka의 컴퓨터 보조 정자 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 유용한 소형 teleost 모델에 대해 지정된 이러한 절차는 척추 동물 남성의 생식력에 영향을 미치는 환경, 생리 학적 및 유전 적 요인에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
Introduction
일본 메다카는 동아시아가 원산지인 작은 알을 낳는 민물 텔레오스트 물고기입니다. Medaka는 생태 독성학, 발달 유전학, 유전체학, 진화 생물학 및 생리학 연구 1,2를위한 우수한 척추 동물 모델 시스템이되었습니다. 인기있는 제브라 피쉬와 유사하게, 그들은 번식하기 쉽고 많은 일반적인 물고기 질병 1,2에 매우 강합니다. 짧은 생성 시간, 투명한 배아 1,2 및 시퀀싱 된 게놈3을 포함하여 medaka를 모델로 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 제브라 피쉬와 달리 메다 카는 성 결정 유전자 4뿐만 아니라 고온 (4-40 ° C) 및 염분 (유리할린 종) 내성5을 가지고 있습니다. 또한 생물학 연구를 용이하게하기 위해 프로토콜 6,7,8,9,10,11,12뿐만 아니라 많은 유전 및 해부학 적 도구가 medaka에서 개발되었습니다.
번식은 종이 영속할 수 있도록 하는 필수적인 생리적 기능입니다. 척추 동물 번식에는 여성의 난 모세포 생성과 남성의 정자 생산을 포함하여 정밀하게 조정 된 무수한 사건이 필요합니다. 정자는 정자 형성의 복잡한 과정을 통해 생산되는 독특한 세포로, 고품질 제품13의 전달을 보장하기 위해 여러 가지 체크 포인트가 있습니다. 배우자의 품질은 수정 성공과 유충 생존에 미치는 영향으로 인해 양식 및 어류 개체군 연구에서 초점이 되었습니다. 따라서 정자의 질은 척추 동물의 남성 생식력의 중요한 지표입니다.
물고기 정자의 질을 평가하는 세 가지 유용한 요소는 운동성, 진보성 및 수명입니다. 퍼센트 운동성과 점진적 운동성은 정자의 질을 나타내는 일반적인 지표이며, 이는 프로그레시브 운동이 필요하고 수정 성공과 밀접한 상관관계가 있기 때문입니다14,15. 대부분의 teleost 종에서 정자가 2 분 미만 동안 완전히 운동성을 유지하고 정자의 궤적이 일반적으로 포유류15보다 덜 선형이기 때문에 운동 지속 시간은 물고기에서 중요한 지표입니다. 그러나 과거에 정자 운동성을 평가하는 많은 연구는 정자를 분석하는 주관적 또는 반 정량적 방법에 의존했습니다15,16. 예를 들어, medaka의 정자 운동성은 과거에 현미경으로 시각적으로 추정되었습니다17. 또한 정자의 움직임을 기록하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 프레임을 병합하고 수영 경로와 속도18,19,20을 측정하여 추정되었습니다. 이러한 접근법은 종종 견고성이 부족하여 분석15,21을 수행하는 사람에 따라 다른 결과를 제공합니다.
컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)은 처음에 포유류를 위해 개발되었습니다. CASA는 자동화된 방식으로 속도와 궤적을 기록하고 측정하여 정자의 질을 평가하는 빠른 정량적 방법입니다15. 어류에서는 정자의 질에 대한 여러 수질 오염 물질의 영향을 모니터링하고, 가금류를 개선하기위한 흥미로운 선조를 식별하고, 냉동 보존 및 저장의 효율성을 개선하고, 수정 조건을 최적화하기 위해 여러 종에서 사용되었습니다15. 따라서 다양한 척추 동물 종에서 정자의 질을 안정적으로 평가할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 물고기 간의 번식 전략의 중요한 다양성으로 인해 teleost 물고기의 정자는 포유류의 정자 및 한 물고기 종에서 다른 물고기 종으로 다릅니다. 배우자를 물에 방출하여 외부에서 알을 주로 수정하는 Teleost 물고기는 내부적으로 수정되어 물의 희석을 보상 할 필요는 없지만 더 점성이있는 유체를 견뎌야하는 포유류와 달리 선조체가없는 비교적 단순한 구조의 고농축 정자를 가지고 있습니다14. 또한 대부분의 물고기의 정자는 빠르게 움직이지만 활성화 후 2 분 미만 동안 완전히 운동성이 있지만 몇 가지 예외가 있습니다15,22. 대부분의 물고기에서 운동성이 급격히 감소 할 수 있기 때문에 물고기에 대한 정자 분석 프로토콜을 결정할 때 활성화 후 분석시기에 극도의주의를 기울여야합니다.
번식은 텔레오스트와 메다카가 모델 유기체로 광범위하게 사용된 생물학 분야 중 하나입니다. 실제로 메다카 수컷은 짝짓기보호 23,24와 같은 흥미로운 생식 및 사회적 행동을 보입니다. 또한이 종25,26,27에서 번식의 신경 내분비 조절을 연구하기 위해 여러 형질 전환 라인이 존재합니다. 큰 물고기에서는 비교적 간단한 절차 인 정자 샘플링은 작은 모델 물고기에서는 정자를 덜 생산하고 더 섬세하기 때문에 더 복잡 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 해부된 고환 17,28,29,30을 분쇄하여 메다카 추출물 milt(물고기 정액)에서 정자 샘플링을 포함하는 대부분의 연구. 몇몇 연구에서는 수정 된 복부 마사지를 사용하여 milt를 활성화 매체18,19,20으로 직접 표현합니다. 그러나이 방법을 사용하면 추출 된 milt의 양과 색상을 시각화하기가 어렵습니다. 제브라 피쉬에서 복부 마사지는 일반적으로 모세관(31,32,33)에 즉시 수집되는 milt를 표현하는 데 사용됩니다. 이 방법을 사용하면 정자의 질을 빠르고 간단하게 나타내는 사정 색을 관찰 할 수있을뿐만 아니라 milt의 부피를 추정 할 수 있습니다32,33. 따라서 정자 수집 및 분석을위한 명확하고 잘 설명 된 프로토콜은 medaka에 부족합니다.
따라서이 기사에서는 작은 모델 물고기 일본 medaka에서 정자 수집의 두 가지 방법, 즉 고환 해부와 모세 관을 사용한 복부 마사지에 대해 설명합니다. 그것은 두 가지 접근법 모두 medaka에 대해 실현 가능하다는 것을 보여 주며 물고기가 절차에서 빠르게 회복됨에 따라 복부 마사지를 반복적으로 여러 번 수행 할 수 있음을 보여줍니다. 또한 medaka 정자 품질 (운동성, 진행성, 수명 및 상대 정자 농도)의 몇 가지 중요한 지표를 안정적으로 측정하기 위해 medaka에서 컴퓨터 지원 정자 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 유용한 소형 teleost 모델에 대해 지정된 이러한 절차는 척추 동물 남성의 생식력에 영향을 미치는 환경, 생리 학적 및 유전 적 요인에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
삼투압은 물고기 정자36,37의 활성화에 중요한 요소입니다. 일반적으로, 정자는 고환에서 움직이지 않으며, 해양 어류의 경우 정액에 비해 고 삼투압 인 배지에서 운동성이되고, 민물 고기의 경우 정액에 비해 저 삼투압 (hypo-tricomtic)이됩니다37. 혈액과 유사하게, 민물 고기의 정액 혈장은 일반적으로 해양 어류보다 낮습니다 (400 mOsmol / k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 노르웨이 생명 과학 대학과 미국 풀 브라이트 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 어류 시설 유지 보수를 위해 NMBU의 Anthony Peltier와 Lourdes Carreon G Tan과 INRAE (프랑스)의 ISC LPGP의 Guillaume Gourmelin에게 이러한 방법을 추가로 테스트 할 수있는 어류 및 실험실 공간을 제공 한 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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