Сбор спермы и компьютерный анализ спермы в модели Teleost японская медака (Oryzias latipes)

Summary

В данной статье описаны два быстрых и эффективных метода сбора спермы у мелкомодельных рыбок медака (Oryzias latipes), а также протокол достоверной оценки качества спермы с помощью компьютерного анализа спермы (CASA).

Abstract

Японская медака (Oryzias latipes) — телеостная рыба и новая модель позвоночных для экотоксикологии, развития, генетики и физиологических исследований. Медака также широко используется для исследования размножения позвоночных, что является важной биологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Качество спермы является важным показателем мужской фертильности и, таким образом, успешности размножения. Методы извлечения спермы и анализ спермы хорошо документированы для многих видов, включая телеостных рыб. Сбор спермы относительно прост у более крупных рыб, но может быть более сложным у мелких модельных рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. В данной статье, таким образом, описаны два метода сбора спермы у маленькой образцовой рыбки, японской медаки: рассечение яичек и массаж живота. Эта статья демонстрирует, что оба подхода возможны для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, поскольку рыба быстро восстанавливается после процедуры. В данной статье также описан протокол компьютерного анализа спермы в медаке для объективной оценки нескольких важных показателей качества сперматозоидов медака (подвижность, прогрессивность, продолжительность подвижности, относительная концентрация). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

Introduction

Японская медака – это небольшая, откладывающая яйца пресноводная рыба, родом из Восточной Азии. Medaka стала отличной модельной системой позвоночных для экотоксикологии, генетики развития, геномики и эволюционной биологии и физиологических исследований ^1,2. Подобно популярным рыбкам данио, они относительно просты в разведении и очень устойчивы ко многим распространенным заболеваниям рыб ^1,2. Существует несколько преимуществ использования медаки в качестве модели, включая короткое время генерации, прозрачные эмбрионы ^1,2 и секвенированный геном³. В отличие от рыбок данио, медака имеет определяющий пол ген⁴, а также толерантность к высокой температуре (от 4-40 °C) и солености (эвригалинные виды)⁵. Кроме того, многие генетические и анатомические инструменты, а также протоколы 6,7,8,9,10,11,12 были разработаны в медаке для облегчения изучения ее биологии.

Размножение является важной физиологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Размножение позвоночных требует множества точно организованных событий, включая производство ооцитов у самок и производство спермы у самцов. Сперматозоиды являются уникальными клетками, полученными в результате сложного процесса сперматогенеза, в котором существует ряд контрольных точек, гарантирующих доставку высококачественного продукта¹³. Качество гамет стало центром внимания в аквакультуре и исследованиях популяций рыб из-за его влияния на успех оплодотворения и выживание личинок. Поэтому качество спермы является важным показателем мужской фертильности у позвоночных.

Тремя полезными факторами для оценки качества спермы рыб являются подвижность, прогрессивность и долговечность. Процент подвижности и прогрессирующая подвижность являются общими показателями качества спермы, поскольку прогрессивное движение необходимо и сильно коррелирует с успехом оплодотворения^14,15. Продолжительность движения также является важным показателем у рыб, поскольку сперматозоиды остаются полностью подвижными менее 2 мин у большинства видов телеостов, а траектория сперматозоидов, как правило, менее линейна, чем у млекопитающих¹⁵. Однако многие исследования, оценивающие подвижность сперматозоидов в прошлом, опирались на субъективные или полуколичественные методы анализа сперматозоидов^15,16. Например, подвижность сперматозоидов в медаке оценивалась в прошлом визуально под микроскопом¹⁷. Он также был оценен путем регистрации движения сперматозоидов и использования программного обеспечения для визуализации для слияния кадров и измерения траектории плавания и скорости 18,19,20. Таким подходам часто не хватает надежности, обеспечивая различные результаты в зависимости от человека, выполняющего анализ^15,21.

Компьютерный анализ спермы (CASA) был первоначально разработан для млекопитающих. CASA – это быстрый количественный метод оценки качества спермы путем регистрации и измерения скорости и траектории автоматическим способом¹⁵. У рыб он использовался у различных видов для мониторинга воздействия нескольких загрязнителей воды на качество спермы, для выявления интересных прародителей для улучшения маточного поголовья, для повышения эффективности криоконсервации и хранения, а также для оптимизации условий для оплодотворения¹⁵. Поэтому он является мощным инструментом для достоверной оценки качества спермы у разных видов позвоночных. Однако из-за важного разнообразия репродуктивных стратегий между рыбами сперма телеостных рыб отличается от спермы млекопитающих и от одного вида рыб к другому. Телеостные рыбы, которые в основном оплодотворяют икру внешне, выпуская гаметы в воду, имеют высококонцентрированные сперматозоиды, которые относительно просты по структуре без акросом, в отличие от млекопитающих, которые оплодотворяются внутренне и поэтому не должны компенсировать разбавление в воде, но должны выдерживать больше вязких жидкостей¹⁴. Кроме того, сперматозоиды большинства рыб движутся быстро, но полностью подвижны менее чем через 2 минуты после активации, хотя есть несколько исключений^15,22. Поскольку подвижность может быстро снижаться у большинства рыб, следует проявлять крайнюю осторожность со сроками анализа после активации при определении протокола анализа спермы для рыб.

Размножение является одной из областей в биологии, в которой телеосты и медака широко используются в качестве модельных организмов. Действительно, самцы медаки демонстрируют интересное репродуктивное и социальное поведение, такое как мат, охраняющий^23,24 человека. Кроме того, существует несколько трансгенных линий для изучения нейроэндокринного контроля размножения у этого вида 25,26,27. Отбор проб спермы, процедура, которая относительно проста у более крупных рыб, может быть более сложной у мелких моделей рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. По этой причине большинство исследований, связанных с отбором проб спермы в медаке, извлекают milt (сперму рыбы) путем дробления рассеченных яичек 17,28,29,30. В нескольких исследованиях также используется модифицированный массаж живота для экспрессии молока непосредственно в активирующую среду 18,19,20; однако с помощью этого метода трудно визуализировать количество и цвет извлеченного молока. У рыбок данио массаж живота обычно используется для сцеживания молока, которое сразу собирается в капиллярную трубку 31,32,33. Этот метод позволяет оценить объем молока, а также наблюдать цвет эякулята, который является быстрым и простым показателем качества спермы^32,33. Поэтому для медаки отсутствует четкий и хорошо описанный протокол сбора и анализа спермы.

Поэтому в данной статье описаны два метода сбора спермы у маленькой модели рыбки японской медаки: рассечение яичек и массаж живота капиллярными трубками. Это демонстрирует, что оба подхода осуществимы для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, так как рыба быстро восстанавливается после процедуры. В нем также описывается протокол компьютерного анализа спермы в медаке для надежного измерения нескольких важных показателей качества спермы медака (подвижность, прогрессивность, долговечность и относительная концентрация сперматозоидов). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

Protocol

Все эксперименты и обращение с животными проводились в соответствии с рекомендациями по благополучию экспериментальных животных в Норвежском университете естественных наук (NMBU). Эксперименты проводились с использованием взрослого (6-9-месячного) самца японской медаки (штамм Hd-rR), выра?…

Representative Results

Тип полученных данныхАнализ подвижности сперматозоидов с помощью программного обеспечения SCA Evolution предоставляет данные о подвижности (процент подвижных и неподвижных сперматозоидов), а также о прогрессивности (процент прогрессивных и непрогрессирующих сперматозоидов) и …

Discussion

Осмоляльность является важным фактором активации сперматозоидов рыб^36,37. Как правило, сперматозоиды являются бессодержательными в яичках и становятся подвижными в средах, которые являются гиперосмотическими относительно семенной жидкости для морских …

Materials

1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040