Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (Oryzias latipes)
Summary
Este artículo describe dos métodos rápidos y eficientes para recolectar esperma del pequeño pez modelo medaka (Oryzias latipes), así como un protocolo para evaluar de manera confiable la calidad del esperma utilizando el análisis de esperma asistido por computadora (CASA).
Abstract
La medaka japonesa (Oryzias latipes) es un pez teleósteos y un modelo emergente de vertebrados para la investigación en ecotoxicología, desarrollo, genética y fisiología. Medaka también se utiliza ampliamente para investigar la reproducción de vertebrados, que es una función biológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La calidad del esperma es un indicador importante de la fertilidad masculina y, por lo tanto, del éxito de la reproducción. Las técnicas para extraer espermatozoides y el análisis de espermatozoides están bien documentadas para muchas especies, incluido el pez teleósteo. La recolección de esperma es relativamente simple en peces más grandes, pero puede ser más complicada en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Este artículo, por lo tanto, describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo, la medaka japonesa: disección de testículos y masaje abdominal. Este documento demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que los peces se recuperan rápidamente del procedimiento. Este artículo también describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para evaluar objetivamente varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, duración de la motilidad, concentración relativa). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.
Introduction
La medaka japonesa es un pequeño pez teleósteos de agua dulce nativo del este de Asia. Medaka se ha convertido en un excelente sistema modelo de vertebrados para ecotoxicología, genética del desarrollo, genómica y biología evolutiva y estudios de fisiología 1,2. Al igual que el popular pez cebra, son relativamente fáciles de criar y altamente resistentes a muchas enfermedades comunes de los peces 1,2. Hay varias ventajas de usar medaka como modelo, incluyendo un corto tiempo de generación, embriones transparentes 1,2 y un genoma secuenciado3. A diferencia del pez cebra, la medaka tieneun gen 4 determinante del sexo, así como una alta tolerancia a la temperatura (de 4-40 °C) y a la salinidad (especies eurihalinas)5. Además, muchas herramientas genéticas y anatómicas, así como los protocolos 6,7,8,9,10,11,12, se han desarrollado en medaka para facilitar el estudio de su biología.
La reproducción es una función fisiológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La reproducción de vertebrados requiere una miríada de eventos orquestados con precisión, incluida la producción de ovocitos en las hembras y la producción de esperma en los machos. Los espermatozoides son células únicas, producidas a través del complejo proceso de espermatogénesis, en el que existen una serie de puntos de control para garantizar la entrega de un producto de alta calidad13. La calidad de los gametos se ha convertido en un foco en la acuicultura y los estudios de poblaciones de peces debido a su impacto en el éxito de la fertilización y la supervivencia larval. La calidad del esperma es, por lo tanto, un indicador importante de la fertilidad masculina en vertebrados.
Tres factores útiles para evaluar la calidad del esperma de los peces son la motilidad, la progresividad y la longevidad. El porcentaje de motilidad y la motilidad progresiva son indicadores comunes de la calidad del esperma, ya que el movimiento progresivo es necesario y se correlaciona fuertemente con el éxito de la fertilización14,15. La duración del movimiento también es un indicador importante en los peces, ya que los espermatozoides permanecen completamente móviles durante menos de 2 minutos en la mayoría de las especies de teleósteos y la trayectoria de los espermatozoides es generalmente menos lineal que en los mamíferos15. Sin embargo, muchos estudios que evaluaron la motilidad de los espermatozoides en el pasado se basaron en métodos subjetivos o semicuantitativos para analizar los espermatozoides15,16. Por ejemplo, la motilidad de los espermatozoides en medaka ha sido estimada visualmente en el pasado bajo un microscopio17. También se ha estimado mediante el registro del movimiento de los espermatozoides y el uso de software de imágenes para fusionar marcos y medir la trayectoria y la velocidad de natación18,19,20. Tales abordajes muchas veces carecen de robustez, proporcionando resultados diferentes según la persona que realiza el análisis15,21.
El análisis de esperma asistido por computadora (CASA) se desarrolló inicialmente para mamíferos. CASA es un método cuantitativo rápido para evaluar la calidad del esperma mediante el registro y la medición de la velocidad y la trayectoria de manera automatizada15. En peces, se ha utilizado en diferentes especies para monitorear los efectos de varios contaminantes del agua en la calidad del esperma, para identificar progenitores interesantes para mejorar los reproductores, para mejorar la eficiencia de la criopreservación y almacenamiento, y para optimizar las condiciones para la fertilización15. Por lo tanto, es una herramienta poderosa para evaluar de manera confiable la calidad del esperma en diferentes especies de vertebrados. Sin embargo, debido a la importante diversidad en las estrategias reproductivas entre los peces, el esperma de los peces teleósteos difiere del de los mamíferos y de una especie de pez a otra. Los peces teleósteos, que fertilizan principalmente los huevos externamente liberando gametos en el agua, tienen espermatozoides altamente concentrados que son relativamente simples en estructura sin acrosoma, a diferencia de los mamíferos, que fertilizan internamente y, por lo tanto, no tienen que compensar la dilución en el agua, pero sí tienen que soportar fluidos más viscosos14. Además, los espermatozoides de la mayoría de los peces se mueven rápidamente, pero son completamente móviles durante menos de 2 minutos después de la activación, aunque hay varias excepciones15,22. Debido a que la motilidad puede disminuir rápidamente en la mayoría de los peces, se debe tener extremo cuidado con el momento del análisis después de la activación al determinar un protocolo de análisis de esperma para peces.
La reproducción es uno de los campos de la biología en los que los teleósteos y medaka se han utilizado ampliamente como organismos modelo. De hecho, los machos medaka muestran comportamientos reproductivos y sociales interesantes, como la protección de la pareja23,24. Además, existen varias líneas transgénicas para estudiar el control neuroendocrino de la reproducción en esta especie25,26,27. El muestreo de esperma, un procedimiento que es relativamente simple en peces más grandes, puede ser más complicado en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Por esta razón, la mayoría de los estudios que involucran muestreo de espermatozoides en extracto de medaka (semen de pescado) mediante aplastamiento de testículos disecados 17,28,29,30. Algunos estudios también utilizan un masaje abdominal modificado para expresar la lecha directamente en el medio activador18,19,20; Sin embargo, con este método es difícil visualizar la cantidad y el color de la lecha extraída. En el pez cebra, el masaje abdominal se usa comúnmente para expresar la lecha, que se recoge inmediatamente en un tubo capilar31,32,33. Este método permite estimar el volumen de la leche, así como la observación del color de la eyaculación, que es un indicador rápido y simple de la calidad del esperma32,33. Por lo tanto, falta un protocolo claro y bien descrito para la recolección y análisis de espermatozoides para medaka.
Por lo tanto, este artículo describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo japonés medaka: disección de testículos y masaje abdominal con tubos capilares. Demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que el pez se recupera rápidamente del procedimiento. También describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para medir de manera confiable varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, longevidad y concentración relativa de espermatozoides). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La osmolalidad es un factor importante en la activación de los espermatozoides de peces36,37. Generalmente, los espermatozoides son inmóviles en los testículos y se vuelven móviles en medios que son hiperosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces marinos, e hipoosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces de agua dulce37. Al igual que en la sangre, el plasma seminal en los peces de agua dulce es t?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido financiado por la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida y el programa Fulbright de Estados Unidos. Los autores desean agradecer a Anthony Peltier y Lourdes Carreon G Tan en NMBU por el mantenimiento de las instalaciones pesqueras y a Guillaume Gourmelin del ISC LPGP en INRAE (Francia) por proporcionar peces y espacio de laboratorio para probar aún más estos métodos.
Materials
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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