Entschlüsselung des molekularen Mechanismus und der Funktion von porenbildenden Toxinen mit Leishmania major
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das Leishmania major promastigotes verwendet, um die Bindung, Zytotoxizität und Signalisierung zu bestimmen, die durch porenbildende Toxine induziert werden. Ein Proof-of-Concept mit Streptolysin O wird bereitgestellt. Andere Toxine können auch verwendet werden, um die in L. major verfügbaren genetischen Mutanten zu nutzen, um neue Mechanismen der Toxinresistenz zu definieren.
Abstract
Das Verständnis der Funktion und des Mechanismus von porenbildenden Toxinen (PFTs) ist eine Herausforderung, da Zellen den durch PFTs verursachten Membranschäden widerstehen. Während biophysikalische Ansätze helfen, die Porenbildung zu verstehen, stützen sie sich oft auf reduktionistische Ansätze, denen das vollständige Komplement von Membranlipiden und Proteinen fehlt. Kultivierte menschliche Zellen bieten ein alternatives System, aber ihre Komplexität und Redundanzen in Reparaturmechanismen erschweren die Identifizierung spezifischer Mechanismen. Im Gegensatz dazu bietet der für die kutane Leishmaniose verantwortliche humane Protozoenerreger Leishmania major eine optimale Balance zwischen Komplexität und physiologischer Relevanz. L. major ist genetisch beherrschbar und kann in vitro zu hoher Dichte kultiviert werden, und jeder Einfluss von Störungen auf Infektionen kann di etablierten Mausmodellen gemessen werden. Darüber hinaus synthetisiert L. major Lipide, die sich von ihren Gegenstücken bei Säugetieren unterscheiden, was die Membrandynamik verändern könnte. Diese Veränderungen in der Membrandynamik können mit PFTs aus der am besten charakterisierten Toxinfamilie, den cholesterinabhängigen Cytolysinen (CDCs), untersucht werden. CDCs binden an Ergosterol in der Leishmania-Membran und können L. major promastigotes abtöten, was darauf hindeutet, dass L. major ein geeignetes Modellsystem zur Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen der PFT-Funktion ist . Diese Arbeit beschreibt Methoden zum Testen der PFT-Funktion in L. major Promastigoten, einschließlich Parasitenkultur, genetischen Werkzeugen zur Beurteilung der Lipidempfindlichkeit, Membranbindungsassays und Zelltodtests. Diese Assays werden die schnelle Verwendung von L. major als leistungsfähiges Modellsystem zum Verständnis der PFT-Funktion über eine Reihe von evolutionär unterschiedlichen Organismen und Gemeinsamkeiten in der Lipidorganisation ermöglichen.
Introduction
Porenbildende Toxine (PFTs) sind die größte Familie bakterieller Toxine1, aber die Mechanismen, mit denen sie Zellen perforieren und zerstören, sind kaum verstanden. Die am besten untersuchte Familie porenbildender Toxine ist die der cholesterinabhängigen Cytolysine (CDCs). CDCs werden hauptsächlich von grampositiven Bakterien synthetisiert, einschließlich des Erregers der nekrotisierenden Fasziitis, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes sezerniert das CDC-Streptolysin O (SLO), das als Monomere an Sterole in der Plasmamembran von Wirtszellen bindet, oligomerisiert und ~20-30 nm Poren in die Membraneinfügt 1. Die Rolle, die Lipide in diesem Prozess spielen, ist nach wie vor schlecht bestimmt.
Ein Ansatz zur Untersuchung von Lipid-CDC-Wechselwirkungen ist die Verwendung chemisch definierter Liposomen. Während definierte Liposomen Informationen über die notwendigen Schwellenwerte von Lipiden liefern, um die Toxinbindung und Porenbildung aufrechtzuerhalten3,4, rekapitulieren sie die zellulären Funktionen nicht vollständig. Zum Beispiel fehlt rekonstituierten Liposomen die Lipidasymmetrie von Säugetierwirten und Lipidmodifikationen als Reaktion auf Toxine5. Eine Alternative zu Liposomen ist die Verwendung von Säugetierzelllinien. Während diese Zelllinien physiologisch relevanter sind, gibt es ein hohes Maß an Redundanz in den Toxinsensor- und Resistenzmechanismen2. Infolgedessen bleiben die Reparaturwege, die verwendet werden, um CDCs zu widerstehen, schlecht bestimmt. Insbesondere ist der Ca2+ Zustrom der primäre Aktivator der Membranreparatur1. Stromabwärts des Ca2+-Zustroms sind mehrere Signalwege angelegt, darunter ein Ceramid-abhängiger Reparaturweg 6,7 und ein MEK-abhängiger Reparaturweg6. Diese Signalwege interagieren mit anderen Proteineffektoren, einschließlich des für den Transport erforderlichen endosomalen Sortierkomplexes (ESCRT)8 und der Annexine 6,9,10. Die Analyse dieser Signalwege in Säugetierzellen ist aufgrund der Redundanz, die die Dateninterpretation durcheinander bringt, eine Herausforderung.
Eine Möglichkeit, Komplexität mit Einfachheit für die Analyse von Reparaturwegen in Einklang zu bringen, ist die Verwendung einfacherer Organismen wie Protozoenpathogene der Gattung Leishmania. Leishmania sp. verursachen Leishmaniose bei Menschen und anderen Tieren. Die Leishmaniose reicht von der kutanen Leishmaniose (selbstlimitierende Hautläsionen) bis zur tödlichen viszeralen Leishmaniose (Hepatosplenomegalie), abhängig von der Spezies und anderen Faktoren11. Leishmania major, der Erreger der kutanen Leishmaniose, wird über einen Sandmückenvektor auf den Menschen übertragen und wird verwendet, um die Leishmanienfunktion und -infektion zu verstehen12. Darüber hinaus sind Leishmania sp. digenic12. Sie existieren als intrazelluläre Makrophagenparasiten von Säugetieren, die als Amastigotes bezeichnet werden, und als frei schwimmende, begeißelte Promastigoten in der Sandfliege12. L. major Promastigoten können in serumergänzten Medien wie M199 zu hoher Dichte kultiviert werden13. Promastigoten sind auch genetisch beherrschbar; Es gibt viele Gen-Knockouts, einschließlich solcher, die auf Lipidbiosynthesewege abzielen13. Diese Knockouts können hinsichtlich des Wachstums und der Unterschiede in der Infektiosität und Läsionsentwicklung durch Infektion von Balb/c-Mäusen bewertet werden13.
Zusätzlich zu der relativen Leichtigkeit der Leishmania-Kultur und der Bandbreite der Lipidbiosynthese-Knockouts hat der Parasit ein einfacheres Genom als Säugetiere. Die am besten charakterisierte Art von Leishmania ist L. major, die viele genetische Werkzeuge hat, wie Mutanten mit defektem Fettstoffwechsel14. Bemerkenswerterweise fehlen viele Reparaturproteine. Für L. major wurden bisher keine Homologe für wichtige Reparaturproteine von Säugetieren wie Annexine identifiziert. Dies ermöglicht die Charakterisierung evolutionär konservierter Reparaturwege ohne die Komplexität von Säugetiersystemen. Reparaturwege wurden in Leishmanien bisher jedoch nicht charakterisiert. Gleichzeitig sind wichtige Signalwege, die an der Reparatur beteiligt sind, wie der MEK-Signalweg6, in Leishmania sp.15,16 erhalten, obwohl Homologe validiert werden müssen. Der Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalweg (MAPK) ist in L. mexicana gut untersucht, wo er zum intrazellulären Überleben und zur Thermostabilität in Säugetierzellen beiträgt und die Metazyklogenese steuert16. In Leishmania sp. wurden 10 der 15 MAPKs17 charakterisiert. Es wird vorhergesagt, dass LmMAPK9 und LmMAPK13 dem ERK1/2 von Säugetieren am ähnlichsten sind, basierend auf der Identität in der konservierten Phosphorylierungslippensequenz. Die Phosphorylierungslippensequenz ist TEY sowohl für Säugetiere ERK1/2 als auch für LmMAPK9 und LmMAPK13. Acht der Leishmania MAPKs haben jedoch ein TDY-Phosphorylierungsmotiv15. Mindestens zwei Homologe von MEK wurden in Leishmania sp., LmxMKK18 und MEKK-related kinase (MRK1)19 identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass die in Leishmanien identifizierten Erkenntnisse auf Säugetiersysteme übertragen werden könnten. Wo sie nicht in Säugetiersysteme übersetzt werden, stellen sie therapeutische Ziele für die Behandlung von Leishmaniose dar.
Um L. major Promastigoten zur Untersuchung der Membranreparatur und der Wechselwirkungen mit Toxinen zu verwenden, sind Techniken mit mittlerem Durchsatz erforderlich. Während hochauflösende Lebendzellbildgebung die Visualisierung markierter Proteine und Membranen in Echtzeit ermöglicht, ist sie ein geringer Durchsatz und misst möglicherweise nicht das Überleben der Zellen. Medium-Throughput-Rentabilitätstests umfassen die mittels Durchflusszytometrie gemessene Farbstoffaufnahme, die Messung der mitochondrialen Aktivität oder die Freisetzung zellulärer Proteine wie Laktatdehydrogenase (LDH). In Säugetierzellen messen LDH-Assays den Zelltod nicht quantitativ20. Darüber hinaus erlauben populationsbasierte Assays wie LDH-Freisetzung oder mitochondriale Aktivität keine robuste Einzelzell- oder multiparametrische Analyse20. Im Gegensatz dazu ermöglichen durchflusszytometrische Assays eine multiparametrische Einzelzellanalyse20. Diese Assays wurden jedoch nicht angewendet, um die Toxinbiologie oder Reaktionen auf Toxine in L. major promastigotes zu verstehen.
In dieser Studie wird SLO als Werkzeug verwendet, um die Plasmamembranstörung der Sphingolipid-Nullmutante von L. major in zwei verschiedenen Puffern zu verstehen – dem M199-Medium, das routinemäßig zur Kultivierung von L. major-Promastigoten verwendet wird, und dem einfacheren Tyrode-Puffer. Ein Durchflusszytometrie-Assay mit mittlerem Durchsatz wird beschrieben und verwendet, um Toxin-Dosis-Wirkungs-Kurven zu erzeugen. Die Daten des durchflusszytometrischen Assays werden zu einer logistischen Kurve modelliert, um die LC50-Werte zu bestimmen. Mit diesen Informationen kann eine sublytische Dosis von SLO bestimmt werden, so dass MAPK-Antikörper mittels Western Blotting validiert werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurden Methoden zur Untersuchung der molekularen Mechanismen und Funktionen von PFTs beschrieben, wobei der menschliche Erreger Leishmania major als Modellsystem verwendet wurde. Es wurde ein auf Durchflusszytometrie basierender Zytotoxizitätstest mit mittlerem Durchsatz zur Messung der Einzelzelllebensfähigkeit entwickelt. Die Lebensfähigkeit ist auf Bevölkerungsebene quantitativ, da LC50-Werte aus der Dosis-Wirkungs-Kurve mittels logistischer Modellierung berechnet werden könne…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern der Keyel- und Zhang-Labore für ihre kritische Durchsicht des Manuskripts. Die Autoren danken dem College of Arts and Sciences Microscopy für die Nutzung der Einrichtungen.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
Riferimenti
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