Superupplösningsmikroskopi kan ge en detaljerad inblick i organisationen av komponenter inom det synaptonemala komplexet i meios. Här demonstrerar vi ett protokoll för att lösa enskilda proteiner i Caenorhabditis elegans synaptonemala komplex.
Under meios måste homologa kromosomer känna igen och hålla fast vid varandra för att möjliggöra korrekt segregering. En av de viktigaste händelserna som säkerställer interaktionen mellan homologa kromosomer är sammansättningen av det synaptonemala komplexet (SC) i meiotisk profas I. Även om det finns liten sekvenshomologi mellan proteinkomponenter inom SC mellan olika arter, har SC: s allmänna struktur bevarats mycket under evolutionen. I elektronmikrografer framträder SC som en tredelad, stegliknande struktur bestående av laterala element eller axlar, tvärgående filament och ett centralt element.
Att exakt identifiera lokaliseringen av enskilda komponenter inom komplexet med elektronmikroskopi för att bestämma SC: s molekylära struktur är dock fortfarande utmanande. Däremot möjliggör fluorescensmikroskopi identifiering av enskilda proteinkomponenter inom komplexet. Men eftersom SC endast är ~ 100 nm bred kan dess understruktur inte lösas med diffraktionsbegränsad konventionell fluorescensmikroskopi. Således kräver bestämning av SC: s molekylära arkitektur superupplösta ljusmikroskopitekniker såsom strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi eller enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM).
För att upprätthålla strukturen och interaktionerna mellan enskilda komponenter inom SC är det viktigt att observera komplexet i en miljö som ligger nära dess ursprungliga miljö i bakteriecellerna. Därför demonstrerar vi ett immunhistokemi- och avbildningsprotokoll som möjliggör studier av SC: s understruktur i intakt, extruderad Caenorhabditis elegans bakterievävnad med SMLM- och STED-mikroskopi. Direkt fixering av vävnaden på täckglaset minskar provernas rörelse under avbildning och minimerar avvikelser i provet för att uppnå den höga upplösning som krävs för att visualisera SC: s understruktur i dess biologiska sammanhang.
Att minska antalet kromosomer med hälften under meios är nyckeln till att generera hälsosam avkomma i sexuellt reproducerande organismer. För att uppnå denna minskning av kromosomantalet måste homologa kromosomer para ihop och separera under meios I. För att säkerställa korrekt segregering av homologa kromosomer genomgår könsceller en förlängd profas I, under vilken homologa kromosomer parar, synaps och rekombineras för att generera fysiska länkar mellan homologer1. SC har framstått som den centrala strukturen som är nyckeln till att reglera rätt progression genom meiotisk profas2.
SC är ett komplex vars allmänna struktur är evolutionärt bevarad, även om det finns lite homologi mellan dess proteinkomponenter. SC identifierades först i elektronmikrografer som en tredelad, stegliknande struktur bestående av två laterala element eller axlar, en central region bildad av tvärgående filament och ett centralt element 3,4. Att bestämma organisationen av enskilda komponenter inom komplexet är nyckeln till att främja vår förståelse av SC: s roll under meiotisk profas.
Modellorganismen C. elegans är idealisk för att studera SC: s struktur och funktion eftersom dess bakterielinjer innehåller ett stort antal meiotiska kärnor med helt monterade SCs5. Genetiska och biokemiska studier har visat att kromosomaxlarna bildas av tre distinkta kohesinkomplex6,7 och fyra HORMA-domänproteiner som kallas HTP-1/2/3 och HIM-3 7,8,9,10,11 i C. elegans. I den centrala regionen av SC har sex proteiner som innehåller domäner med lindad spole hittills identifierats 12,13,14,15,16,17. För att överbrygga avståndet mellan de två axlarna dimeriseras SYP-1, -5 och -6 på ett head-to-head-sätt (figur 1), medan ytterligare tre proteiner stabiliserar deras interaktion i det centrala elementet16,17,18,19.
Att få detaljerad inblick i organisationen av dessa proteiner är avgörande för att förstå SC: s många funktioner under meios. Eftersom bredden på SC: s centrala region endast är ~ 100 nm, kan dess understruktur inte lösas med diffraktionsbegränsad fluorescensmikroskopi. Visualisering av komponenter i en struktur av denna storlek kan dock lätt uppnås genom superupplösningsmikroskopi. Faktum är att strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), expansionsmikroskopi 20, STED-mikroskopi (stimulerad emission utarmning) 21 och enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM)22,23 har framträtt som viktiga verktyg för att studera SC: s molekylära arkitektur över arter 16,24,25,26,27,28,29, 30.
För att övervinna upplösningsgränsen förlitar sig STED-mikroskopi på att överlagra den diffraktionsbegränsade platsen för emissionsljuset med en munkformad stråle från STED-lasern, vilket teoretiskt begränsar punktspridningsfunktionen ner till molekylära dimensioner31,32. Den upplösning som praktiskt taget kan uppnås med STED inom biologiska prover ligger dock kvar i intervallet några tiotals nanometer i xy33.
Ännu högre upplösning i biologiska prover kan erhållas med SMLM-tekniker. SMLM utnyttjar de blinkande egenskaperna hos specifika fluoroforer för att lösa objekt på subdiffraktionsnivån genom att separera rumsligt överlappande fluoroforer i tid. Provet avbildas sedan upprepade gånger för att fånga olika delmängder av fluoroforer. Fluoroforernas position i provet bestäms sedan genom att punktspridningsfunktionen (PSF) anpassas till de erhållna signalerna över alla bilder, vilket kan lösa strukturer ner till 15 nm23,34.
Sammantaget kodar de lokaliserade bilderna positionerna för alla fluoroforer. Upplösningen av SMLM bestäms av märkningstätheten och fluoroforens blinkande egenskaper. Enligt Nyquist-Shannon-kriteriet är det omöjligt att på ett tillförlitligt sätt lösa objekt som är mindre än dubbelt så stora som det genomsnittliga avståndet mellan etikett och etikett. Således behövs en hög märkningstäthet för högupplöst avbildning. För SC i C. elegans kan en hög märkningstäthet uppnås genom att använda epitoptaggar fästa på specifika platser för endogena proteiner med hjälp av genomredigering. Epitoptaggarna kan sedan färgas med hög densitet med hjälp av specifika monoklonala antikroppar med hög affinitet19,30. Samtidigt måste on-cykeln för enskilda fluoroforer vara tillräckligt kort för att säkerställa att rumsligt överlappande fluoroforer inte fångas upp samtidigt35.
På grund av dessa två krav kräver upplösning av strukturen hos stora makromolekylära komplex som SC avbildning av ett tillräckligt stort antal bilder och kan därför ta flera timmar. Fallgropen med långa avbildningstider är att prover tenderar att driva på grund av scenens rörelse eller små strömmar inom provbufferten; Även små rörelser i storleksordningen 10 nm är skadliga vid NM-upplösning och måste korrigeras för. De driftkorrigeringsmetoder som vanligtvis används är dock inte tillräckligt robusta för att exakt lägga över bilder av två kanaler som avbildas sekventiellt36. Detta är problematiskt eftersom biologiska frågor ofta ber om exakt detektion och lokalisering av flera mål inom samma prov. För att kringgå dessa problem har metoder som ratiometrisk avbildning utvecklats. Ratiometrisk avbildning möjliggör samtidig avbildning av flera fluoroforer med överlappande excitations- och emissionsspektra, med en efterföljande tilldelning av varje detekterad signal till dess respektive fluorofor baserat på förhållandet mellan intensiteter i spektralt distinkta kanaler37,38.
Dessutom kräver studier av organisationen av makromolekylära komplex som SC tredimensionell (3D) information. För att uppnå superupplösning i tre dimensioner (3D-SMLM) är en cylindrisk lins integrerad i den optiska vägen för det utsända ljuset som snedvrider formen på PSF för en fluorofor beroende på dess avstånd från fokalplanet. Därför kan den exakta positionen för en fluorofor i z-planet extrapoleras genom att analysera formen på dess emissionssignal35,39. Genom att kombinera dessa framsteg inom SMLM möjliggörs avbildning av 3D-organisationen av makromolekylära komplex, inklusive SC.
SC: s stegliknande organisation, som är avgörande för korrekt rekombination och segregering av homologa kromosomer, observerades först för nästan 70 år sedan i elektronmikroskopi 3,4. Medan den övergripande organisationen av SC lätt löses i elektronmikroskopi, kräver lokaliseringen av enskilda komponenter inom detta komplex ett mer riktat tillvägagångssätt. Med sin bredd på endast ~ 100 nm kan SC: s understruktur inte lösas med konventionell fluorescensmikroskopi. Superupplösningsmikroskopi har dock blivit en viktig drivkraft för nya upptäckter om strukturen och funktionen hos det synaptonemala komplexet 16,19,24,25,26,27,28,29,30. För att underlätta denna forskning har vi demonstrerat ett monteringsförfarande som gör det möjligt att studera SC: s arkitektur inom C. elegans gonadvävnad med SMLM och STED-mikroskopi.
Ett kritiskt steg för att optimera upplösningen vid SMLM-avbildning är att direkt tvärbinda bakterievävnaden till en poly-L-lysinbelagd täckglas (steg 4). Den kovalenta bindningen av vävnaden till täckglaset är avgörande för att minska rörelser i provet som skulle resultera i stora drifter och göra avbildning under långa tidsperioder för SMLM omöjlig. Dessutom leder även en suboptimal fastsättning som lämnar kärnorna innehållande SCs på ett avstånd från täckglaset till en signifikant minskning av den uppnåeliga upplösningen till följd av sfäriska avvikelser (figur 4). Alternativt till det kovalenta fästet som används här kan färgad könsvävnad också immobiliseras mellan två förseglade täckglas i en liten droppe bildbuffert19,30. Denna immobiliseringsmetod minskar emellertid kraftigt volymen av bildbuffert i provet från 1 ml som används i det optimerade protokollet här till bara några μL, vilket kommer att resultera i en försurning av bildbufferten och kraftigt minska den tid för vilken provet kan avbildas 38,53,54.
Långa förvärvstider för både SMLM- och STED-mikroskopi begränsar användningen av dessa metoder till avbildning av kemiskt fixerade prover. Här säkerställer paraformaldehydfixering att SC: s struktur bevaras under provberedning och avbildning. Trots de försiktighetsåtgärder som vidtagits här för att avbilda SC i intakt vävnad är den resulterande strukturen hos SC efter fixering inte nödvändigtvis identisk med strukturen i sitt ursprungliga tillstånd i en levande organism. Dessutom, eftersom en enda bild av den fasta SC representerar en enda “ögonblicksbild” av den biologiska strukturen, förblir detta tillvägagångssätt blind för dynamiken i den ursprungliga strukturen in vivo.
Information om dynamiken och variationen i makromolekylära strukturer kan emellertid också erhållas genom att förvärva inte bara en enda utan många “ögonblicksbilder”. Även om detta tillvägagångssätt kan lösa förändringar i SC: s struktur under pachytene19, finns det flera faktorer som begränsar antalet bilder som kan förvärvas från ett enda prov som framställts med detta protokoll. För det första leder de höga laserkrafterna som används vid bildförvärv till permanent blekning av fluoroforerna och utesluter avbildning av angränsande regioner av intresse eller flera z-plan, vilket avsevärt minskar antalet bilder som kan förvärvas från ett enda prov. För det andra är prov-/vävnadstätheten på täckglaset som framställts med denna metod låg, vilket avsevärt begränsar antalet bilder som kan förvärvas från en enda täckglidning. Den låga provdensiteten förbjuder också användningen av automatiserade bildförvärvsledningar som hjälpte till att belysa andra biologiska frågor 34,55,56,57,58,59. Provdensiteten kan dock ökas något av en erfaren användare.
Protokollet som presenteras här är optimerat för att erhålla en hög märkningstäthet som är nödvändig för att uppnå optimal upplösning i SMLM35. Medan tidigare protokoll kovalent fäster vävnaden på täckglaset före immunfärgning16, tvärbinder detta nya protokoll vävnaden till täckglaset först efter att proverna färgats i lösning. Denna modifiering gör det möjligt för antikropparna som används för immunmärkning att fritt komma åt vävnaden från alla sidor, medan den kovalenta bindningen av vävnaden till täckglaset kan begränsa antikroppar från att nå kärnorna närmast täckglaset, vilket minskar graden av märkning. Tillsammans förbättrar de modifieringar som beskrivs här upplösningen från 40-50 nm (FRC-upplösning)16 till 30-40 nm (detta protokoll).
Viktigt är att även om en hög märkningstäthet och en hög koncentration av antikroppar är avgörande för SMLM, fann vi att bättre STED-mikroskopibilder erhålls med lägre antikroppskoncentrationer (steg 3). Vid en upplösning på tiotals nanometer blir storleken på molekylerna som används för att märka proteinet av intresse allt viktigare. Vi använde därför F(ab’)2-fragment som är hälften så stora som fullängdsantikroppar. Förbättringen av lokal kontrast på grund av en mindre signalkälla, och därför upplösning som erhållits genom denna modifiering jämfört med användning av sekundära antikroppar i full längd, möjliggjorde upplösningen av de två C-terminerna av SYP-5 inom den centrala regionen av TauSTED, som inte löses av konventionell STED med användning av antikroppar i full längd (16 och data visas inte). Vi förväntar oss att detta optimerade protokoll för avbildning av SCs i intakta C. elegansbakterieller kommer att underlätta undersökningen av SC: s struktur-funktionsförhållande under meios.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Jonas Ries och Ries-labbet för att de delar bildbuffertar för SMLM-avbildning. Vi tackar också Yumi Kim för C. elegans-stammen som används i detta protokoll och Abby F. Dernburg för kyckling-anti-HTP-3-antikroppen. Vi tackar Marko Lampe och Stefan Terjung från Advanced Light Microscopy Facility på EMBL Heidelberg för deras stöd i användningen av Olympus iXplore SPIN SR konfokalmikroskop. Detta arbete stöddes av European Molecular Biology Laboratory och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation – 452616889, SK). Vi erkänner tillgången och tjänsterna som tillhandahålls av Imaging Centre vid European Molecular Biology Laboratory (EMBL IC), generöst stöd av Boehringer Ingelheim Foundation.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |