فحص السمية القلبية عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات الخلايا العضلية القلبية الناضجة المستحثة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية
Summary
توفر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) بديلا لاستخدام الحيوانات لفحص السمية القلبية قبل السريرية. من القيود المفروضة على التبني الواسع النطاق ل hiPSC-CMs في فحص السمية قبل السريرية هو النمط الظاهري غير الناضج الذي يشبه الجنين للخلايا. تظهر هنا بروتوكولات للنضج القوي والسريع ل hiPSC-CMs.
Abstract
تستخدم الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) لتحل محل وتقليل الاعتماد على الحيوانات والخلايا الحيوانية لاختبار السمية القلبية قبل السريرية. في تنسيقات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد ، تلخص hiPSC-CMs بنية ووظيفة خلايا عضلة القلب البشرية البالغة عند زراعتها على مصفوفة مثالية خارج الخلية (ECM). ينضج ECM المشتق من الخلايا الجذعية البشرية في الفترة المحيطة بالولادة (مصفوفة خارج الخلية تحفز النضج) هيكل hiPSC-CM ووظيفته وحالة التمثيل الغذائي في 7 أيام بعد الطلاء.
تستجيب أحاديات الطبقة الناضجة hiPSC-CM أيضا كما هو متوقع للأدوية ذات الصلة سريريا ، مع وجود خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية. كان نضوج الطبقات الأحادية hiPSC-CM عقبة أمام الاعتماد الواسع النطاق لهذه الخلايا القيمة للعلوم التنظيمية وفحص السلامة ، حتى الآن. تقدم هذه المقالة طرقا تم التحقق من صحتها للطلاء والنضج والتنميط الظاهري الوظيفي عالي الإنتاجية لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية والانقباض hiPSC-CM. تنطبق هذه الطرق على خلايا عضلة القلب النقية المتاحة تجاريا ، وكذلك خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي يتم إنشاؤها داخليا باستخدام بروتوكولات تمايز عالية الكفاءة خاصة بالغرفة.
يتم قياس وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية عالية الإنتاجية باستخدام إما الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs ؛ الانبعاثات: 488 نانومتر) ، أو الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم (CSFs) ، أو مستشعرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GCaMP6). يتم استخدام جهاز رسم الخرائط الضوئية عالي الإنتاجية للتسجيلات البصرية لكل معلمة وظيفية ، ويتم استخدام برنامج مخصص مخصص لتحليل البيانات الكهربية. يتم تطبيق بروتوكولات MECM لفحص الأدوية باستخدام مؤثرات إينوتروب إيجابية (إيزوبرينالين) وحاصرات خاصة بقناة الجينات البشرية المرتبطة بالأثير (hERG). ستمكن هذه الموارد الباحثين الآخرين من الاستفادة بنجاح من hiPSC-CMs الناضجة لفحص السمية القلبية قبل السريرية عالي الإنتاجية واختبار فعالية أدوية القلب وأبحاث القلب والأوعية الدموية.
Introduction
تم التحقق من صحة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) على نطاق دولي ، وهي متاحة لفحص السمية القلبية في المختبر 1. يمكن إنشاء hiPSC-CMs عالية النقاء بأعداد غير محدودة تقريبا ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها. عند إعادة الطلاء ، يقومون أيضا بإعادة التنشيط ويبدأون في التعاقد مع إيقاع يذكرنا بقلب الإنسان 2,3. ومن اللافت للنظر أن hiPSC-CMs الفردية تتزاوج مع بعضها البعض وتشكل تخليقية وظيفية تنبض كنسيج واحد. في الوقت الحاضر ، يتم اشتقاق hiPSCs بشكل روتيني من عينات دم المريض ، لذلك يمكن تمثيل أي شخص باستخدام فحوصات فحص السمية القلبية hiPSC-CM في المختبر 4,5. هذا يخلق الفرصة لإجراء “التجارب السريرية في طبق” ، مع تمثيل كبير من مجموعات سكانية متنوعة6.
تتمثل إحدى المزايا الحاسمة على مناهج فحص السمية القلبية للخلايا الحيوانية والحيوانية الحالية في أن hiPSC-CMs تستخدم الجينوم البشري الكامل وتقدم نظاما في المختبر مع أوجه تشابه وراثية مع قلب الإنسان. هذا جذاب بشكل خاص لعلم الصيدلة الجيني والطب الشخصي – من المتوقع أن يوفر استخدام hiPSC-CMs للأدوية وتطوير العلاجات الأخرى وصفات أدوية أكثر دقة ودقة وأمانا. في الواقع ، أثبتت فحوصات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) hiPSC-CM أنها تنبئ بسمية القلب للأدوية ، باستخدام لوحة من الأدوية المستخدمة سريريا مع خطر معروف للتسبب في عدم انتظام ضربات القلب1،7،8،9. على الرغم من الإمكانات الهائلة ل hiPSC-CMs والوعد بتبسيط وجعل تطوير الأدوية أرخص ، كان هناك إحجام عن استخدام هذه المقايسات الجديدة10،11،12.
حتى الآن ، فإن أحد القيود الرئيسية على التبني والقبول الواسع النطاق لفحوصات فحص hiPSC-CM هو مظهرها غير الناضج الشبيه بالجنين ، فضلا عن وظيفتها. تمت مراجعة ومناقشة القضية الحرجة لنضج hiPSC-CM في الأدبيات العلمية ad nauseum13،14،15،16. وبالمثل ، تم استخدام العديد من الأساليب لتعزيز نضوج hiPSC-CM ، بما في ذلك التلاعب بالمصفوفة خارج الخلية (ECM) في أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد وتطوير أنسجة القلب المهندسة ثلاثية الأبعاد (EHTs) 17،18. في الوقت الحالي ، هناك اعتقاد سائد على نطاق واسع بأن استخدام 3D EHTs سيوفر نضجا فائقا مقارنة بالنهج القائمة على 2D أحادية الطبقة. ومع ذلك ، توفر الطبقات الأحادية 2D كفاءة أعلى لاستخدام الخلايا وزيادة النجاح في الطلاء مقارنة ب 3D EHTs ؛ تستخدم 3D EHTs أعدادا أكبر من الخلايا ، وغالبا ما تتطلب إدراج أنواع أخرى من الخلايا يمكن أن تربك النتائج. لذلك ، في هذه المقالة ، ينصب التركيز على استخدام طريقة بسيطة لنضج hiPSC-CMs المستزرعة كطبقة أحادية 2D من الخلايا المقترنة كهربائيا وميكانيكيا.
يمكن تحقيق نضج hiPSC-CM المتقدم في أحادي الطبقات 2D باستخدام ECM. يمكن نضج الطبقات الأحادية 2D من hiPSC-CMs باستخدام غطاء بوليديميثيل سيلوكسان ناعم ومرن ، مطلي بمصفوفة غشاء قاعدي تفرزها خلية ساركوما فأر Engelbreth-Holm-Swarm (الماوس ECM). في عام 2016 ، أظهرت التقارير أن hiPSC-CMs المستزرعة على حالة ECM الناعمة هذه نضجت وظيفيا ، حيث أظهرت سرعات توصيل جهد الفعل بالقرب من قيم قلب البالغين (~ 50 سم / ثانية) 18. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه hiPSC-CMs الناضجة العديد من الخصائص الكهربية الأخرى التي تذكرنا بقلب البالغين ، بما في ذلك إمكانات غشاء الراحة المفرط الاستقطاب والتعبير عن Kir2.1. في الآونة الأخيرة ، حددت التقارير طلاء ECM البشري المشتق من الخلايا الجذعية في الفترة المحيطة بالولادة والذي يعزز النضج الهيكلي ل 2D hiPSC-CMs19. هنا ، يتم تقديم طرق سهلة الاستخدام لأحادية الطبقات 2D hiPSC-CM الناضجة هيكليا لاستخدامها في الشاشات الكهربية عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، نقدم التحقق من صحة أداة رسم الخرائط الضوئية للاكتساب والتحليل الآلي لوظيفة الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الطبقة 2D hiPSC-CM ، باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) والمجسات والبروتينات الحساسة للكالسيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة طرق مختلفة لفحص سمية القلب في المختبر باستخدام hiPSC-CMs. قدمت ورقة “أفضل الممارسات” الأخيرة حول استخدام hiPSC-CMs المقايسات المختلفة في المختبر ، وقراءاتها الأولية ، والأهم من ذلك ، دقة كل فحص لتحديد وظيفة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب البشري20. بالإضافة إلى استخدام ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL148068-04 و R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
Riferimenti
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
