Præsenteret her er et sæt protokoller til generering og kryopræservering af hjertesfæroider (CS’er) fra menneskeinducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter dyrket i et multidimensionelt format med høj kapacitet. Denne tredimensionelle model fungerer som en robust platform til sygdomsmodellering, screeninger med høj kapacitet og opretholder sin funktionalitet efter kryopræservering.
Human-induceret pluripotent stamcelle-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) er af afgørende betydning for human hjertesygdom modellering og terapi. Vi offentliggjorde for nylig en omkostningseffektiv strategi for den massive udvidelse af hiPSC-CM’er i to dimensioner (2D). To store begrænsninger er celle umodenhed og mangel på tredimensionelt (3D) arrangement og skalerbarhed i high-throughput screening (HTS) platforme. For at overvinde disse begrænsninger udgør de udvidede kardiomyocytter en ideel cellekilde til generering af 3D-hjertecellekultur og vævstekniske teknikker. Sidstnævnte har et stort potentiale på det kardiovaskulære område og giver mere avanceret og fysiologisk relevant HTS. Her beskriver vi en HTS-kompatibel arbejdsgang med nem skalerbarhed til generering, vedligeholdelse og optisk analyse af hjertesfæroider (CS’er) i et 96-brøndsformat. Disse små CS’er er afgørende for at udfylde hullet i nuværende in vitro-sygdomsmodeller og / eller generering til 3D-vævstekniske platforme. CS’erne præsenterer en meget struktureret morfologi, størrelse og cellulær sammensætning. Desuden viser hiPSC-CM’er, der dyrkes som CS’er, øget modning og flere funktionelle træk ved det menneskelige hjerte, såsom spontan calciumhåndtering og kontraktil aktivitet. Ved automatisering af hele arbejdsgangen, fra generering af CS’er til funktionel analyse, øger vi intra- og interbatchreproducerbarheden som demonstreret ved high-throughput (HT) billeddannelse og calciumhåndteringsanalyse. Den beskrevne protokol muliggør modellering af hjertesygdomme og vurdering af lægemiddel/terapeutiske virkninger på enkeltcelleniveau i et komplekst 3D-cellemiljø i en fuldautomatisk HTS-arbejdsgang. Derudover beskriver undersøgelsen en enkel procedure til langsigtet konservering og biobanking af helsfæroider, hvilket giver forskere mulighed for at skabe næste generations funktionelle vævsopbevaring. HTS kombineret med langtidsopbevaring vil bidrage væsentligt til translationel forskning på en lang række områder, herunder lægemiddelopdagelse og testning, regenerativ medicin og udvikling af personaliserede terapier.
Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC’er) gav hidtil usete muligheder for at studere menneskelig udvikling og sygdom på celleniveau. I løbet af det sidste årti er der ved hjælp af udviklingslektioner etableret forskellige protokoller for at sikre effektiv differentiering af hiPSC’er i kardiomyocytter (CM’er)1,2,3,4. hiPSC-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM’er) kan tjene som en ressource til modellering af genetisk arvelige hjerte-kar-sygdomme (CVD’er), test af hjertesikkerhed for nye lægemidler og hjerteregenerative strategier 5,6,7,8. På trods af den rettede hjertedifferentiering af hiPSC’er forbliver ubestemte CM-numre en udfordring inden for hjerteområdet, da modne hiPSC-CM’er generelt er ikke-proliferative, og primære humane celler ikke er tilgængelige i store mængder.
For nylig beskrev vi, at samtidig Wnt-signalaktivering med kultur med lav celletæthed resulterede i et massivt proliferativt respons (op til 250 gange) af hiPSC-CM’er 9,10. Denne omkostningseffektive strategi for massiv udvidelse af hiPSC-CM’er via seriel passaging i kulturkolbeformat letter standardisering og kvalitetskontrol af et stort antal funktionelle hiPSC-CM’er. For at holde trit med efterspørgslen efter store partier hiPSC-CM’er fra forskellige donorer er biobanking af hiPSC-CM’er desuden blevet beskrevet10. Imidlertid er kardiomyocytmonolag, der er podet i disse standardkulturretter, ikke repræsentative for den komplekse 3D-struktur, der findes i hjertet. Desuden er hiPSC-CM’ernes umodenhed forblevet en hindring og har således ikke efterlignet den biologiske og fysiologiske fænotype i di vivo-kardiovaskulærmiljøet.
Nye 3D in vitro-modeller er blevet udviklet, hvor hiPSC-CM’er viser tættere fysiologisk adfærd såsom selvorganisering 11,12, ekstracellulær matrix (ECM) remodellering 13, forbedret modning 14,15,16 og synkroniseret sammentrækning17,18,19 . 3D-modeller er blevet brugt til lægemiddelopdagelse, test af lægemiddelkardiotoksicitet, sygdomsmodellering, regenerative terapier og endda de første kliniske forsøg 20,21,22,23,24. En af de mest anvendte modeller er det fibrinbaserede konstruerede hjertevæv (EHT), som udviser et vævslignende arrangement og hjertekontraktilitet13,17,25. Tidligere viste vi, at EHT’er genereret fra udvidede hiPSC-CM’er viste sammenlignelig kontraktilitet med dem fra uudvidede hiPSC-CM’er, hvilket demonstrerede kompromisløs cellulær funktionalitet efter ekspansion9. Selv om genereringen af EHT’er fra hiPSC-CM’er er veletableret, forventes der ikke desto mindre yderligere udvikling med hensyn til oprettelsen af en HT-vurderingsplatform. Her muliggør den hurtige generering af et stort antal selvaggregerende hjertesfæroider (CS’er) i 96-brøndformat en forbedring af 3D-betingelserne til HTS-formål (high-throughput screening).
Samlet set er fordelen ved CS’er som 3D-cellekultur deres høje reproducerbarhed og skalerbarhed. Især kan CS’er kombineret med robotprøvehåndtering standardisere og automatisere CS-kultur, lægemiddelbehandling og analyse af højt indhold20. Her beskriver vi optimerede protokoller til generering af CS’er af høj renhed og høj kvalitet, som effektivt kan kryopræserveres og screenes for hjertefunktion ved at udføre Ca2+ forbigående målinger ved hjælp af et optisk calciumoptagelses- og analysesystem. Denne model giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til at udføre skærme med høj kapacitet på hundreder til tusinder af sfæroider17,18.
Opdagelse af hjertemedicin hæmmes af en afhængighed af ikke-menneskelige dyre- og cellulære modeller med utilstrækkelig gennemstrømning og fysiologisk troskab til nøjagtigt at udføre aflæsninger. hiPSC-CM-biologi kombineret med HT-instrumentering og fysiologiske sonder har potentialet til at genindføre humane modeller i de tidligste stadier af hjertesygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse. Vi udviklede en 3D-metode til generering af hjertevæv, der producerer funktionelle CS’er af høj kvalitet til en optimal hjertesygdomsmodellering og lægemiddelscreeningsplatform. Derudover giver kombinationen af sfæroidteknologien i 3D-bioreaktorsystemer til industriel EV-produktion mulighed for et nødvendigt skridt mod klinisk oversættelse af EV-baseret terapi. Metoden beskrevet her er afhængig af flere afgørende faktorer og er en variant af eksisterende protokoller 9,10,28,29. Disse metoder omfatter: 1) generering af 3D-vævskonstruktioner, 2) det optimale celleantal og timing før screeningen, 3) forbedring af instrumenternes følsomhed og høje gennemstrømningskapacitet og 4) at kunne fryse sfæroiderne før enhver funktionel analyse. I modsætning til tidligere beskrevne protokoller beskriver den foreslåede protokol generering af op til 1.500 sfæroider om dagen og egnetheden til HTS. Konventionel analyse af hundrede forbindelser over 6 x 0,5 logdoser til 10 replikater ved hjælp af eksisterende 96-brønds calciumbilleddannelsessystemer eller 24-godt multiplekset konstrueret hjertevæv kræver ca. 500 millioner til 3 milliarder hiPSC-CM’er31,32. Den foreslåede anvendelse gør hjertescreeninger billigere og tidseffektive sammenlignet med de konventionelle systemer, da pladerne med 96 brønde kun krævede 10% af såtætheden sammenlignet med den beskrevne metode. Sammenlignet med tidligere protokoller, såsom hængedråbemetoden, muliggør genereringen af sfæroider ved selvaggregering i ultralave fastgørelsesplader desuden automatiseret billeddannelse af enkelt mikrovæv af høj kvalitet33.
Denne lille 3D-model efterligner den biologiske og fysiologiske fænotype i in vivo kardiovaskulært miljø. Som tidligere påvist øges calciumtransienter dramatisk i 3D-hjertevævskonstruktioner sammenlignet med 2D-enkeltlagscellekulturer34.
Dernæst fandt vi, at såtætheden og korrekt dyrkningstid også er kritiske faktorer for en vellykket CS-screening. Tætheden af 10K-20K hiPSC-CM’er pr. sfæroid og screening mellem uge 2-3 efter generation var optimal, mens for små eller for gamle sfæroider viser forstyrret calciumhåndtering (figur 2 og figur 3). Derfor er det vigtigt at opretholde såtætheder så konsistente som muligt, da størrelsen påvirker de funktionelle parametre. Selvom denne optiske metode giver gode resultater for levende 3D-kulturer som et helt væv, er det udfordrende at indhente data inden for større sfæroider på (sub-) cellulært niveau uden at stole på tidskrævende histologimetoder. For nylig er der offentliggjort flere tilgange, der brugte “optisk clearing”, som muliggør erhvervelse af hele 3D-sfæroider med mulighed for enkeltcellekvantificering af markører. Her tilpassede vi en 3-dages protokol fra CS-høst til billedanalyse, som er optimeret til 3D-billeddannelse ved hjælp af konfokalmikroskopi29 (figur 1C og figur 4D).
Endelig, med stigningen i 3D-hjertevævsapplikationer og kommercielle applikationer, stiger efterspørgslen efter langtidsopbevaring og patientspecifik biobank fra forskellige donorer. Kryopræservering er en effektiv strategi til at generere HTS-plader fra flere batcher over tid. Frysning af hiPSC-CM’er er beskrevet tidligere og adskiller sig ikke fra andre dyrkede celletyper 10,35,36. For nylig er tilgange til frysning af plader med 2D-celler blevet beskrevet37. Her fandt vi, at PSC-kryopræserveringssættet er den mest optimale tilstand sammenlignet med tre andre (data ikke vist) og brugte dette medium til effektiv frysning af sfæroider. Efter kryopræservering forbliver levedygtigheden høj (figur 4B, C), men CS’ernes elektrofysiologiske egenskaber påvirkes, og der kræves en inkubationsperiode efter optøning. Faktisk viste CS’er 1 uge efter optøning spontan slagaktivitet og calciumhåndtering. Det er imidlertid blevet beskrevet, at friske og genvundne hiPSC-CM’er ikke altid udviser identiske molekylære og fysiologiske egenskaber38. Denne begrænsning skal overvejes, når kryopræserverede hiPSC-CM’er anvendes til vurdering af lægemiddelinducerede hjerteaflæsninger. Selvom vi effektivt modulerer antallet af celler pr. sfæroid og den optimale timing af calciumtransient billeddannelse, kunne hjertesfæroiderne forbedres ved at blande hiPSC-afledte kardiomyocytceller med endotelceller, fibroblaster, cellecellekrydsninger og ekstracellulære matricer, såsom chitosan, kollagen IV, fibronectin, matrigel eller laminin, der efterligner in vivo-hjertemiljøet 39, 40. Samlet set foreslår vi en trinvis protokol til effektivt at generere CS’er, der er egnede til downstream-applikationer såsom sygdomsmodellering og HT-lægemiddelscreening.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende VALA-videnskaberne for Cyteseer-softwarepakken og optimering af den automatiserede 3D-calciumanalyse. Vi ønsker at anerkende tilskud fra PLN Foundation (RM). P.A.D. og F.S. støttes af CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. støttes af H2020-EVICARE (#725229) fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC). J.W.B. støttes af UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship og CVON-Dosis young talent grant; Nederlandske Heart Foundation (CVON-Dosis 2014-40). N.C. støttes af gravitationsprogrammet “Materials Driven Regeneration” af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (RegmedXB #024.003.013) og Marie Skłodowska-Curie-aktionerne (tilskudsaftale RESCUE #801540). V.S.-P. støttes af Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. er støttet af det EU-finansierede projekt BRAVE (H2020, ID:874827)
24 wells suspenion plate | Corning | 3738 | |
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning | CLS3474-24EA | |
Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | Dilution: 1:200 |
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) | Abcam | ab45932 | Dilution: 1:200 |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Roche | 10735086001 | |
Cal-520, AM | Abcam | ab171868 | |
Confocal microscope | Leica | DMi8 | |
Confocal microscope software | Leica | Las X | |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Creatine monohydrate | Sigma-Aldrich | C3630 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Concentration: 1 µg/mL |
DMEM no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | 76050771.05 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glycerol | Boom | 76050771.05 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | Dilution: 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | Dilution: 1:500 |
Horizontal shaker | IKA | 4003000 | |
Human induced pluripotent stem cell lines | (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) | CVI-273 (control 1) | |
Human induced pluripotent stem cell lines | Germany | 141 (control 2) 144 (control 3) | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem | 265.2.5L-PL | 10 M stock solution, corrosive |
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype | BD | 556652 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828 | Protect from light |
L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
Myocyte calcium and contractility system | Leica | Thunder, DMi8 | |
Non essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140 | |
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 | Santa Cruz | SC281692 | Hazardous |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
PES Membrane Vacuum Filter system | Corning | 431097 | |
PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | Dilution: 1:1000 |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | A2644601 | |
RevitaCell | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875 | |
Silicone Elastomer Kit | SYLGARD | 184 | |
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) | Sigma-Aldrich | 71736 | |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Tris Fisher | Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Merck | X100-1L | Hazardous |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Urea | Sigma-Aldrich | 51456 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Tocris | 1254 | Protect from light |