Presentert her er et sett med protokoller for generering og kryopreservering av hjertesfæroider (CS) fra humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter dyrket i et multidimensjonalt format med høy gjennomstrømning. Denne tredimensjonale modellen fungerer som en robust plattform for sykdomsmodellering, screening med høy gjennomstrømning, og opprettholder funksjonaliteten etter kryopreservering.
Menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) er av avgjørende betydning for human hjertesykdomsmodellering og terapi. Vi publiserte nylig en kostnadseffektiv strategi for massiv utvidelse av hiPSC-CMs i to dimensjoner (2D). To store begrensninger er celle umodenhet og mangel på tredimensjonal (3D) arrangement og skalerbarhet i HTS-plattformer (High Throughput Screening). For å overvinne disse begrensningene danner de utvidede kardiomyocyttene en ideell cellekilde for generering av 3D-hjertecellekultur og vevsteknikkteknikker. Sistnevnte har stort potensial innen kardiovaskulær felt, og gir mer avansert og fysiologisk relevant HTS. Her beskriver vi en HTS-kompatibel arbeidsflyt med enkel skalerbarhet for generering, vedlikehold og optisk analyse av hjertesfæroider (CS) i et 96-brønns format. Disse små CS-ene er avgjørende for å fylle gapet som finnes i dagens in vitro sykdomsmodeller og/eller generering for 3D-vevstekniske plattformer. CS-ene presenterer en svært strukturert morfologi, størrelse og cellulær sammensetning. Videre viser hiPSC-CMs dyrket som CSs økt modning og flere funksjonelle egenskaper i det menneskelige hjertet, for eksempel spontan kalsiumhåndtering og kontraktil aktivitet. Ved å automatisere hele arbeidsflyten, fra generering av dataemner til funksjonsanalyse, øker vi reproduserbarheten internt og mellom partier, som demonstrert av HT-avbildning (High Throughput (HT) og kalsiumhåndteringsanalyse. Den beskrevne protokollen tillater modellering av hjertesykdommer og vurdering av medikamentelle / terapeutiske effekter på enkeltcellenivå i et komplekst 3D-cellemiljø i en helautomatisk HTS-arbeidsflyt. I tillegg beskriver studien en enkel prosedyre for langsiktig bevaring og biobanking av hele sfæroider, og gir dermed forskere muligheten til å skape neste generasjons funksjonell vevslagring. HTS kombinert med langtidslagring vil vesentlig bidra til translasjonsforskning på et bredt spekter av områder, inkludert legemiddelforskning og testing, regenerativ medisin og utvikling av personlige terapier.
Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) ga enestående muligheter til å studere menneskelig utvikling og sykdom på mobilnivå. I løpet av det siste tiåret, ved hjelp av utviklingstimer, har ulike protokoller blitt etablert for å sikre effektiv differensiering av hissc i kardiomyocytter (CMs)1,2,3,4. hiPSC-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) kan tjene som en ressurs for modellering av genetisk arvelige kardiovaskulære sykdommer (CVD), testing av hjertesikkerhet for nye legemidler og hjerteregenerative strategier 5,6,7,8. Til tross for den rettede hjertedifferensieringen av hissc, forblir ubestemt CM-tall en utfordring i hjertefeltet, siden modne hiPSC-CM generelt er ikke-proliferative, og primære humane celler ikke er tilgjengelige i høye mengder.
Nylig beskrev vi at samtidig Wnt-signalaktivering med lav celletetthetskultur resulterte i en massiv proliferativ respons (opptil 250 ganger) av hiPSC-CMs 9,10. Denne kostnadseffektive strategien for massiv utvidelse av hiPSC-CMs via seriepassering i kulturkolbeformat letter standardisering og kvalitetskontroll av et stort antall funksjonelle hiPSC-CMer. I tillegg, for å holde tritt med etterspørselen etter store partier av hiPSC-CMs fra ulike givere, har biobanking av hiPSC-CMs blitt beskrevet10. Imidlertid er kardiomyocytmonolag sådd i disse standardkulturrettene ikke representative for den komplekse 3D-strukturen som er tilstede i hjertet. Videre har umodenhet av hiPSC-CMs forblitt et hinder, og dermed kommet til kort i å etterligne den biologiske og fysiologiske fenotypen av in vivo kardiovaskulære miljø.
Nye 3D in vitro-modeller har blitt utviklet der hiPSC-CMs viser nærmere fysiologisk oppførsel som selvorganisering 11,12, ekstracellulær matrise (ECM) remodeling 13, forbedret modning 14,15,16 og synkronisert sammentrekning17,18,19 . 3D-modeller har blitt brukt til narkotikaoppdagelse, medikamentkardiotoksisitetstesting, sykdomsmodellering, regenerative terapier og til og med de første kliniske forsøkene 20,21,22,23,24. En av de mest brukte modellene er fibrinbasert konstruert hjertevev (EHT), som viser et vevslignende arrangement og hjertekontraktilitet13,17,25. Tidligere viste vi at EHT-er generert fra utvidede hiPSC-CM-er viste sammenlignbar kontraktilitet med de fra ikke-utvidede hiPSC-CM-er, noe som demonstrerte kompromissløs cellulær funksjonalitet etter utvidelse9. Likevel, selv om genereringen av EHT-er fra hiPSC-CM-er er godt etablert, forventes det videre utvikling med hensyn til etableringen av en HT-vurderingsplattform. Her tillater den raske genereringen av et stort antall selvaggregerende hjertesfæroider (CS) i 96-brønnformat en forbedring i 3D-forhold for HTS-formål (High Throughput Screening).
Samlet sett er fordelen med datavitenskap som 3D-cellekultur deres høye reproduserbarhet og skalerbarhet. Spesielt kan CS-er kombinert med robotprøvehåndtering standardisere og automatisere CS-kultur, narkotikabehandling og analyse med høyt innhold20. Her beskriver vi optimaliserte protokoller for å generere CS-er av høy renhet og høy kvalitet, som effektivt kan kryopreserveres og screenes for hjertefunksjon ved å utføre Ca2+ forbigående målinger ved hjelp av et optisk kalsiumoppkjøps- og analysesystem. Denne modellen gir et enkelt, men kraftig verktøy for å utføre skjermer med høy gjennomstrømning på hundrevis til tusenvis av sfæroider17,18.
Oppdagelsen av legemidler i hjertet hindres av en avhengighet av ikke-menneskelige dyre- og cellemodeller med utilstrekkelig gjennomstrømning og fysiologisk troskap til å utføre avlesninger nøyaktig. hiPSC-CM-biologi kombinert med HT-instrumentering og fysiologiske prober har potensial til å gjeninnføre menneskelige modeller i de tidligste stadiene av hjertesykdomsmodellering og narkotikaoppdagelse. Vi utviklet en 3D-metode for generering av hjertevev som produserer høykvalitets og funksjonelle CS-er for en optimal plattform for modellering av hjertesykdom og screening av legemidler. I tillegg gir kombinasjonen av sfæroidteknologien i 3D-bioreaktorsystemer for industriell EV-produksjon et nødvendig skritt mot klinisk oversettelse av EV-basert terapi. Metoden beskrevet her er avhengig av flere avgjørende faktorer og er en variant av eksisterende protokoller 9,10,28,29. Disse metodene inkluderer: 1) generering av 3D-vevskonstruksjoner, 2) det optimale cellenummeret og timingen før screeningen, 3) forbedring av følsomhet og høy gjennomstrømningskapasitet for instrumenter, og 4) å kunne fryse sfæroidene før noen funksjonell analyse. I motsetning til tidligere beskrevne protokoller, beskriver den foreslåtte protokollen genereringen av opptil 1,500 sfæroider per dag og egnetheten for HTS. Konvensjonell analyse av hundre forbindelser over 6 x 0,5 loggdoser for 10 replikater ved bruk av eksisterende 96-brønns kalsiumavbildningssystemer eller 24-brønns multiplekset konstruert hjertevev krever omtrent 500 millioner til 3 milliarder hiPSC-CMs31,32. Den foreslåtte applikasjonen gjør hjertescreening mindre kostbar og tidseffektiv sammenlignet med de konvensjonelle systemene, siden 96-brønnplatene bare krevde 10% av såtettheten sammenlignet med den beskrevne metoden. Dessuten, sammenlignet med tidligere protokoller, for eksempel hengende dråpe-metoden, muliggjør generering av sfæroider ved selvaggregering i ultra-lave festeplater høy kvalitet automatisert avbildning av enkeltmikrovev33.
Denne lille 3D-modellen etterligner den biologiske og fysiologiske fenotypen til det kardiovaskulære miljøet in vivo . Som tidligere vist øker kalsiumtransienter dramatisk i 3D-hjertevevskonstruksjoner sammenlignet med 2D monolagscellekulturer34.
Deretter fant vi ut at såtetthet og riktig dyrkingstid også er kritiske faktorer for en vellykket CS-screening. Tetthetene på 10K-20K hiPSC-CM per sfæroid og screening mellom uke 2-3 etter generasjon var optimale, mens for små eller for gamle sfæroider viser forstyrret kalsiumhåndtering (figur 2 og figur 3). Derfor er det viktig å opprettholde såtettheten så konsistent som mulig, siden størrelsen påvirker de funksjonelle parametrene. Selv om denne optiske metoden gir gode resultater for levende 3D-kulturer som et helt vev, er det utfordrende å skaffe data i større sfæroider på (sub-) cellulært nivå uten å stole på tidkrevende histologimetoder. Nylig har flere tilnærminger blitt publisert som brukte “optisk clearing”, som muliggjør oppkjøp av hele 3D-sfæroider med mulighet for enkeltcellekvantifisering av markører. Her tilpasset vi en 3-dagers protokoll fra CS-høsting til bildeanalyse, som er optimalisert for 3D-avbildning ved hjelp av konfokalmikroskopi29 (figur 1C og figur 4D).
Til slutt, med økningen i 3D-hjertevevsapplikasjoner og kommersielle applikasjoner, øker etterspørselen etter langtidslagring og pasientspesifikk biobanking fra ulike givere. Kryopreservering er en effektiv strategi for å generere HTS-plater fra flere partier over tid. Frysing av hiPSC-CM er beskrevet tidligere og er ikke forskjellig sammenlignet med andre dyrkede celletyper 10,35,36. Nylig har tilnærminger for frysing av plater med 2D-celler blitt beskrevet37. Her fant vi at PSC-kryopreserveringssettet er den mest optimale tilstanden sammenlignet med tre andre (data ikke vist) og brukte dette mediet for effektiv frysing av sfæroider. Etter kryopreservering forblir levedyktigheten høy (figur 4B,C), men CSs elektrofysiologiske egenskaper påvirkes og en periode med inkubasjon etter tining er nødvendig. 1 uke etter tining viste kreftskolene spontan slagaktivitet og kalsiumhåndtering. Det er imidlertid beskrevet at ferske og gjenvunnede hiPSC-CM ikke alltid viser identiske molekylære og fysiologiske egenskaper38. Denne begrensningen må vurderes når kryopreserverte hiPSC-CMs brukes til å vurdere legemiddelinduserte hjerteavlesninger. Videre, selv om vi effektivt modulerer antall celler per sfæroid og den optimale timingen av kalsiumforbigående avbildning, kan hjertesfæroidene forbedres ved å blande hiPSC-avledede kardiomyocyttceller med endotelceller, fibroblaster, celle-cellekryss og ekstracellulære matriser, som kitosan, kollagen IV, fibronektin, matrigel eller laminin, som etterligner in vivo hjertemiljøet39, 40. Samlet sett foreslår vi en trinnvis protokoll for effektivt å generere CSs som er egnet for nedstrøms applikasjoner som sykdomsmodellering og HT-medikamentscreening.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne VALA-vitenskap for programvarepakken Cyteseer og optimalisering av den automatiserte 3D-kalsiumanalysen. Vi ønsker å anerkjenne tilskuddsstøtte fra PLN-stiftelsen (RM). P.A.D. og F.S. støttes av CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. støttes av H2020-EVICARE (#725229) fra Det europeiske forskningsrådet (ERC). J.W.B. støttes av UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship og CVON-Dosis stipend for unge talenter; Netherlands Heart Foundation (CVON-Dosis 2014-40). N.C. støttes av gravitasjonsprogrammet “Materials Driven Regeneration” av den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (RegmedXB #024.003.013), og Marie Skłodowska-Curie Actions (Grant agreement RESCUE #801540). VS-P. støttes av Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. er støttet av det EU-finansierte prosjektet BRAVE (H2020, ID:874827)
24 wells suspenion plate | Corning | 3738 | |
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning | CLS3474-24EA | |
Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | Dilution: 1:200 |
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) | Abcam | ab45932 | Dilution: 1:200 |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Roche | 10735086001 | |
Cal-520, AM | Abcam | ab171868 | |
Confocal microscope | Leica | DMi8 | |
Confocal microscope software | Leica | Las X | |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Creatine monohydrate | Sigma-Aldrich | C3630 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Concentration: 1 µg/mL |
DMEM no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
Fructose | Sigma-Aldrich | 76050771.05 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glycerol | Boom | 76050771.05 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | Dilution: 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | Dilution: 1:500 |
Horizontal shaker | IKA | 4003000 | |
Human induced pluripotent stem cell lines | (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) | CVI-273 (control 1) | |
Human induced pluripotent stem cell lines | Germany | 141 (control 2) 144 (control 3) | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem | 265.2.5L-PL | 10 M stock solution, corrosive |
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype | BD | 556652 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828 | Protect from light |
L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
Myocyte calcium and contractility system | Leica | Thunder, DMi8 | |
Non essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140 | |
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 | Santa Cruz | SC281692 | Hazardous |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
PES Membrane Vacuum Filter system | Corning | 431097 | |
PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | Dilution: 1:1000 |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | A2644601 | |
RevitaCell | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | |
RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875 | |
Silicone Elastomer Kit | SYLGARD | 184 | |
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) | Sigma-Aldrich | 71736 | |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | 71718 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Tris Fisher | Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Merck | X100-1L | Hazardous |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Urea | Sigma-Aldrich | 51456 | |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Tocris | 1254 | Protect from light |