这里介绍的是从小鼠齿状回分离的单个细胞核测序的方法,该方法通过荧光激活细胞核(FAN)分选排除大多数神经元。这种方法可生成高质量的表达谱,并促进对生态位中代表的大多数其他细胞类型的研究,包括神经干细胞等稀缺群体。
成人海马神经发生(AHN)包括终生维持齿状回(DG)亚颗粒区(SGZ)内的增殖和静止神经干细胞(NSC),以及它们从新生神经元分化为颗粒细胞层中的颗粒细胞,已在众多研究中得到充分验证。使用转基因动物,特别是啮齿动物,是研究调节AHN的信号通路和研究构成海马神经源性生态位的每种细胞类型的作用的宝贵工具。为了解决后者,将单核分离与下一代测序相结合的方法在AHN领域产生了重大影响,以识别每个细胞群的基因特征。然而,需要进一步完善这些技术,以对DG内更稀有的细胞群进行表型分析。在这里,我们提出了一种方法,该方法利用荧光激活细胞核分选(FANS)从新鲜解剖的DG中分离的单个细胞核悬浮液中排除大多数神经元群,方法是为NeuN抗原选择未染色的细胞核,以便进行单核RNA测序(snRNA-seq)。这种方法是进一步研究AHN的细胞间调节和发现跨物种的新细胞标志物和机制的潜在垫脚石。
成年期海马神经元的连续生成,也称为成人海马神经发生(AHN),与学习、记忆获取/清除和模式分离等认知功能有关,似乎是衰老和神经退行性疾病中预防认知缺陷的恢复力的重要机制1,2,3.啮齿动物一直是使用多种方法研究AHN的首选模型,包括免疫细胞化学和下一代测序(NGS)方法。将这些结果转化为其他物种仍然存在争议。事实上,AHN已经在大多数物种中观察到,但它在一生中持续存在的程度,特别是在人类4,5,6,7,8中,经常引起争论。
迄今为止,已经确认了各种内在和外在信号通路来调节AHN1。然而,细胞间通讯对AHN的影响才刚刚出现9。这可能首先归因于目前已知的细胞标记物的特异性不足,无法对转基因动物进行 体内 分析。事实上,许多研究依赖于在多种细胞类型中表达的双皮质素或神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)等标志物1。其次,成年海马生态位10 的复杂性和高度的细胞多样性为分析每种细胞类型带来了技术挑战。对于生物信息学分析尤其如此,在不同人群(例如 NSC 或神经胶质细胞)的分析管道中使用重叠的细胞标记物,在评估 AHN7,11 时导致有争议的结论。第三,大量的神经元破坏了对不太丰度的细胞群的研究,如星形胶质细胞、少突胶质细胞或室管膜细胞,尽管它们在AHN微调调节中的作用正变得越来越突出9。总之,这些限制影响了将啮齿动物的结果转化为其他物种的能力。由于难以在 体外 概括复杂组织(例如海马神经源性生态位)以及获取高质量组织的许多障碍以及在涉及人体组织的研究中缺乏标准化的组织处理方案,这尤其被放大了12,13。因此,开发新的方法来分析细胞群并鉴定齿状回(DG)内的新细胞标志物至关重要,最终将更好地了解每种细胞类型对AHN调节的不同贡献。
为了实现这一目标,单细胞(sc)和单核(sn)分离与RNA测序相结合已成为研究复杂组织(如DG14)的工具。因此,从小鼠成年海马生态位中分离单细胞的细胞富集策略主要用于检查NSC15,16。通过对 GluR1/Cd24 双阴性单细胞进行测序,应用了一种从 DG 富集非神经元细胞的有趣策略,在生物信息学分析后,1,408 个细胞被测序,星形胶质细胞和 NSC 之间没有明显的簇17。这可能是由于单细胞制备所需的苛刻酶消化会破坏细胞完整性和RNA。为了绕过这一技术问题,已经开发了几种使用单核分离的方法,这些方法特别适用于复杂的组织11,18。然而,DG内神经元的优势或更广泛的海马内嗅系统内神经元的优势会产生采样偏差,以研究这些大脑区域内存在的全部细胞群。此外,用于制备单细胞文库的上样细胞数量有限,这突出了测序单核分析管道中主要细胞群的存在。事实上,大型神经元簇经常被注释和分析,而其他细胞群则代表性不足或遗漏5,11。
为了克服这些偏差并能够分析小鼠DG中存在的神经元以外的细胞类型,本研究使用荧光激活细胞核分选(FANS)18 的原理设计了一种方法,该方法通过阴性选择带有神经元核抗原(NeuN, 也称为 Rbfox3)。这种抗原的选择受到将NeuN描述为可靠神经元标志物19 的文献的指导,并且有必要使用核蛋白进行这种方法。然后将NeuN阴性FACS分选的细胞准备在10x基因组学平台上进行RNA测序。结果表明,排除表达NeuN的细胞可以对神经胶质和稀有细胞群进行细胞类型特异性,高质量的转录组学分析。
为了成功执行该协议,DG的解剖是第一个关键步骤,这需要一些练习以保持其不受损坏并限制周围组织的污染。根据经验,熟练的研究人员可以非常快速地从海马体中分离DG,然后他们可以改进他们的技术以提高解剖的速度,从而提高组织的新鲜度以产生高质量的数据。同样,单核的制备和重悬要求在单个实验中使用的不同条件下保持一致,但也要避免过度移液,这可能会破坏核膜释放环境RNA,从而偏倚测序结果。除了前面提到的制备高质量细胞核的建议外,在进行测序之前,还需要考虑单核悬浮液的浓度。事实上,根据制造商的指南,应稀释浓度高于 1,200 nuc/μL 的制剂,因为这种水平的细胞核浓度形成多重物的风险更高,影响下游生物信息学分析。值得注意的是,由于涉及的成本,对细胞核浓度低于 500 nuc/μL 的样品进行测序可能不值得。还建议遵循高级FACS用户的建议来设置所有设门,并与样品和生物重复的设置保持一致。同样,RNA测序文库的制备需要一些培训才能获得高质量的结果,大多数供应商都有很好的支持来有效地实现这一目标。在这项研究中,该方法仅用新鲜组织进行了测试;然而,FANS 也用冷冻组织进行了 25.因此,可以合理地假设该协议可以用冷冻组织执行,尽管进行了轻微的优化。
该协议的开发考虑了特定的下游应用,即研究海马神经源性生态位内神经元以外的细胞群。事实上,越来越多的证据表明,AHN在衰老中的损害可归因于生态位1,2,3,9内的周围细胞。特别是,星形胶质细胞和少突胶质细胞成为AHN的关键调节因子;然而,它们与DG的分离与RNA测序相结合产生了不同的结果,使得用该技术评估这一假设具有挑战性1,17。与未进行FACS分选的样品相比,这种FACS分选NeuN阴性细胞核的方法允许分离更多的星形胶质细胞和少突胶质细胞,从而实现更好的生物信息学分析。该协议适用于整个生命周期的所有年龄段,这里提供的具有代表性的老年动物组织数据提供了一个概念证明,证明该方法对于研究衰老的海马神经源性生态位是稳健的。为了扩大该方法的使用并使其适应不同的生物学问题,重要的是要考虑其他神经元核膜抗原可以与对这些标志物的最佳验证抗体进行彻底滴定一起进行测试。例如,当研究DG中NSC的神经元分化过程时,一些细胞类型(例如2型细胞或神经母细胞)开始表达NeuN(补充图3)。因此,需要另一种抗原来专门研究这些细胞类型。相反,在NeuN阴性FACS分选后,本研究中仍然鉴定出一些神经元,这可能是由于NeuN在这些人群中的表达低或没有表达(例如,皮质Cajal-Retzius神经元19)。此外,据报道,NeuN在少突胶质细胞26的亚群中表达,如果这些亚群感兴趣,可能会产生偏倚的结果。因此,在开始使用FANS时应仔细考虑抗原的选择,以避免包含或排除细胞群,从而排除对特定生物学问题的准确答案。与此一致,还建议在用该协议验证或反驳测试假设之前,通过正交测定(例如,免疫组织化学或RNA范围)进一步验证每个测序结果。最后,涉及FANS的步骤可以进一步发展,以包括一种以上的抗体,并具有更详细的分选策略,以排除和/或包括所需的细胞群。
最终,该协议中描述的技术在与其他物种一起使用时可能会有一些限制。例如,啮齿动物中生态位的定义非常明确,存在增殖和静止的NSC或限制在DG特定亚区域内的新生神经元,但仍然不清楚如何在其他物种中描绘海马神经源性生态位。事实上,增殖细胞在非人灵长类动物和人类的DG连续区域内并不对齐,而是分散在其周围,也可能存在于杏仁核7中。因此,解剖和隔离比其他物种的DG更广泛的区域可能会影响该协议的使用。特别是,在处理较大的组织块27,28时,需要优化用于制备组织的解离和研磨步骤。关于生物信息学分析,虽然近亲繁殖的啮齿动物具有非常同质且注释良好的基因组,但人类基因组的遗传变异性加上细胞标记数量不足,无法清楚地区分不同的细胞群(例如,NSCs和星形胶质细胞)需要大量的归一化进行分析,当识别出一小簇细胞时,可能导致不同的结论7,11.在这种情况下,细胞富集可能仍然是首选,或者应与其他策略一起使用以提高分析能力。
尽管如此,目前的方法可以研究研究不足但潜在重要的细胞群在AHN调节中的作用。星形胶质细胞群体尤其如此,星形胶质细胞在神经退行性疾病的发作和进展中起着核心作用29,30。这项研究表明,只需排除DG中存在的绝大多数神经元,就可以鉴定和分析星形胶质细胞和其他稀有细胞群。使用不同方法的其他研究无法从相同范围的细胞群中实现类似的细胞核回收率5,11,17。此外,这项研究的结果表明,使用这种方法可以在不对该细胞群进行特异性富集的情况下分离NSC簇15。
总之,遵循和改进该方法将是解决与海马神经源性生态位在调节AHN中的上下文作用相关的悬而未决问题的一步。特别是,它可以为与AHN9调节相关的细胞群中衰老和患病大脑中的基因表达水平带来新的见解,支持鉴定NSC1 的潜在异质性或解决脉管系统在AHN中的作用。最终,这种方法可以适用于具有类似问题和问题的其他成体干细胞生态位。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Lachlan Harris和Piero Rigo的技术支持,感谢Jason M. Uslaner和Ditte Lovatt对手稿的反馈。这项工作得到了MRC的赠款支持以及与MSD,弗朗西斯克里克研究所的竞争前研究合作的支持,该研究所获得了英国癌症研究中心(FC0010089),英国医学研究委员会(FC0010089),威康信托基金会(FC0010089)的资助,并获得了FG的威康信托研究员奖(106187 / Z / 14 / Z)。我们向许多作者道歉,由于篇幅有限,我们无法讨论和引用他们的作品。
0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 |