В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.
Клетки могут активно менять свою форму и становиться подвижными, что зависит от их способности активно реорганизовывать свою внутреннюю структуру. Эта особенность объясняется механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, в частности, цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, миозиновых моторов и вспомогательных белков, которые проявляют внутренние свойства сокращения. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал. Однако эта модель не всегда может объяснить экспериментальные результаты, которые больше согласуются с картиной, описывающей цитоскелет как пороупругий активный материал — эластичную сеть, встроенную в цитозоль. Градиенты сократимости, генерируемые миозиновыми моторами, управляют потоком цитозоля через поры геля, что делает вывод о том, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана. Одной из основных особенностей пороупругости является диффузионная релаксация напряжений в сети, характеризующаяся эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости и вязкости цитозоля (растворителя). Поскольку клетки имеют много способов регулировать свою структуру и свойства материала, наше нынешнее понимание того, как связаны механика цитоскелета и динамика потока цитозолей, остается плохо изученным. Здесь используется подход восстановления in vitro для характеристики свойств материала пороэластичных гелей актомиозина в качестве модельной системы для клеточного цитоскелета. Сокращение геля обусловлено моторной сократимостью миозина, что приводит к возникновению потока проникающего растворителя. В статье описано, как приготовить эти гели и провести эксперименты. Мы также обсудим, как измерять и анализировать поток растворителя и сжатие геля как в локальном, так и в глобальном масштабе. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, обсуждаются экспериментальные проблемы и распространенные ошибки, в том числе их отношение к механике клеточного цитоскелета.
Живые клетки обладают уникальными механическими свойствами. Помимо способности пассивно реагировать на приложенные силы, они также способны активно генерировать силы в ответ на внешние раздражители1. Эти характеристики, которые необходимы для различных клеточных процессов, особенно во время подвижности клеток, в первую очередь объясняются механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, особенно цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, молекулярных моторов миозина и вспомогательных белков. Эти актомиозиновые сети проявляют присущие им свойства самоорганизации и сокращения, обусловленные моторными белками миозина, которые сшивают актиновые филаменты и активно генерируют механические напряжения в сети, подпитываемой гидролизом АТФ2.
Были проведены многочисленные экспериментальные и теоретические исследования по изучению свойств материала цитоскелета3. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал4. Это означает, что на коротких временных масштабах цитоскелет ведет себя как эластичный материал, а на длительных временных масштабах он ведет себя как вязкая жидкость из-за сшивающих белков и моторной отслойки миозина (и повторного прикрепления), что позволяет сети динамически вращаться. Однако во многих ситуациях вязкоупругая модель не может описать экспериментальные результаты, которые в большей степени согласуются с картиной, описывающей цитоскелет и, в более общем плане, цитоплазму клетки, описываемую как пороупругий активный материал 5,6. Эти типы материалов характеризуются двумя основными особенностями. (i) Первой основной особенностью является генерация потока проникающего цитозоля («растворителя») через поры геля за счет градиентов сократительной способности, управляемых моторами миозина, что лежит в основе таких процессов, как клеточный блеббинг7, подвижность8 и колебания формы клетки9. Возникновение таких цитозольных потоков может быть локальным, для блеббинга, или глобальным, как при подвижности клеток. В последнем случае сократительные напряжения в задней части клетки направляют поток цитозольной жидкости к передней части клетки, что пополняет белковый пул, необходимый для сборки ламеллиподий8. (ii) Вторая основная особенность заключается в том, что релаксация напряжений является диффузионной и характеризуется эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости геля и вязкости растворителя5. Константа пороупругой диффузии определяет, насколько быстро система реагирует на приложенное напряжение. Более высокие константы диффузии соответствуют более быстрому перераспределению напряжений. Это, в свою очередь, определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения внутри клетки после приложенного механического напряжения, будь то внешнего или внутреннего, такого как активные сократительные напряжения, генерируемые миозиновыми моторами. Эти примеры, таким образом, демонстрируют, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана и не может рассматриваться отдельно3.
Поскольку ячейки могут регулировать свои механические свойства различными способами, взаимодействие между сетевой механикой и динамикой потока жидкости остается плохо изученным. Мощным альтернативным подходом является использование восстановленных in vitro систем, которые позволяют полностью контролировать различные микроскопические компоненты и параметры системы, что делает эти модельные системы оптимальными для физического анализа10,11. Этот подход был успешно использован для изучения влияния белкового состава и геометрии системы на актиновую подвижность 12,13,14,15,16,17,18, 2D-паттернирование актомиозиновых сетей 19,20,21,22 , а также взаимодействие между сократимостью сети и динамикой потока жидкости пороэластичных гелей актомиозина, которое находится в центре внимания данной статьи23.
В этой рукописи обсуждается получение сократительных эластичных сетей актомиозина контролируемых размеров и свойств материала на основе работы Ideses et al.23. Проанализирована и количественно определена динамика сжимающегося геля и дренированного растворителя, с помощью которой продемонстрировано, что эти гели актомиозина могут быть описаны как пороупругий активный материал. Изучение влияния вязкости растворителя на диффузию напряжений еще раз подтверждает пороупругую природу этих сетей. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, также обсуждаются экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и актуальность экспериментальных результатов для клеточного цитоскелета.
Здесь используется подход in vitro для характеристики механики пороэластичных гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы клетки, которая, как было показано, ведет себя как пороэластический материал 3,5<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Благодарим Дину Аранович за очистку и маркировку белка. Г.Л. благодарен Министерству науки, технологий и космоса Израиля за стипендию доктора философии им. Жаботинского. A.B.G. благодарен Израильскому научному фонду (грант 2101/20) и Министерству науки и технологий Государства Израиль (грант 3-17491) за финансовую поддержку.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |