Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Moirangthem Kiran Singh; Linda J. Kenney

doi:10.3791/64382

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Biologia

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Published: February 10, 2023

doi:

10.3791/64382

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)

Abstract

Os sistemas de secreção tipo três (T3SSs) permitem que bactérias gram-negativas injetem uma bateria de proteínas efetoras diretamente no citosol de células hospedeiras eucarióticas. Após a entrada, as proteínas efetoras injetadas modulam cooperativamente as vias de sinalização eucarióticas e reprogramam as funções celulares, permitindo a entrada e a sobrevivência bacteriana. O monitoramento e a localização dessas proteínas efetoras secretadas no contexto de infecções fornecem uma pegada para definir a interface dinâmica das interações patógeno-hospedeiro. No entanto, marcar e criar imagens de proteínas bacterianas em células hospedeiras sem interromper sua estrutura/função é tecnicamente desafiador.

A construção de proteínas de fusão fluorescente não resolve esse problema, porque as proteínas de fusão obstruem o aparelho secretor e, portanto, não são secretadas. Para superar esses obstáculos, recentemente empregamos um método para marcação fluorescente sítio-específica de efetores secretados por bactérias, bem como outras proteínas difíceis de rotular, usando expansão de código genético (GCE). Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo completo para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio GCE, seguido de instruções para obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)

Descobertas recentes sugerem que a incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) via GCE, seguida de marcação bio-ortogonal com corantes contendo tetrazina, é uma técnica viável para marcação seletiva e visualização de proteínas secretadas por bactérias e posterior análise de imagens no hospedeiro. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser empregado por investigadores interessados em conduzir imagens de super-resolução usando GCE para estudar vários processos biológicos em bactérias e vírus, bem como interações patógeno-hospedeiro.

Introduction

As infecções bacterianas têm sido consideradas como um sério perigo para a saúde humana. Os patógenos utilizam sistemas de defesa altamente evoluídos, extremamente poderosos e intrincados, bem como uma variedade de fatores de virulência bacteriana (referidos como proteínas efetoras) para escapar das respostas imunes do hospedeiro e estabelecer infecções ^1,2. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esses sistemas e o papel de proteínas efetoras individuais ainda são amplamente desconhecidos devido à escassez de abordagens adequadas para seguir diretamente os componentes e efetores cruciais da proteína nas células hospedeiras durante a patogênese.

Um exemplo típico é o sorovar Typhimurium de Salmonella enterica, que causa gastroenterite aguda. Salmonella Typhimurium usa sistemas de secreção tipo três (T3SS) para injetar uma variedade de proteínas efetoras diretamente nas células hospedeiras. Assim que a Salmonella entra na célula hospedeira, ela reside em um compartimento ácido ligado à membrana, denominado vacúolo contendo Salmonella (SCV)^3,4. O pH ácido do SCV ativa a T3SS codificada pela ilha de patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2) e transloca uma quantidade de 20 ou mais proteínas efetoras através da membrana vacuolar para o citosol do hospedeiro 5,6,7,8. No interior do hospedeiro, esses coquetéis complexos de proteínas efetoras manipulam coordenadamente as vias de sinalização da célula hospedeira, resultando na formação de estruturas tubulares complexas e altamente dinâmicas estendidas a partir do SCV ao longo de microtúbulos, denominados filamentos induzidos por Salmonella (SIFs), que permitem que a Salmonella sobreviva e se replique dentro das células hospedeiras^9,10,11.

Métodos para visualizar, rastrear e monitorar localizações de efetores bacterianos, e examinar seu tráfego e interações dentro das células hospedeiras, fornecem informações críticas sobre os mecanismos subjacentes à patogênese bacteriana. A marcação e localização de proteínas efetoras de T3SS secretadas por Salmonella dentro das células do hospedeiro tem se mostrado um desafio tecnológico^12,13; No entanto, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, transformou nossa capacidade de estudar e visualizar proteínas dentro de sistemas vivos. No entanto, o tamanho das proteínas fluorescentes (~25-30 kDa)15 é frequentemente comparável ou até maior do que o da proteína de interesse (POI; por exemplo, ^13,65 kDa para SsaP, 37,4 kDa para SifA). De fato, a marcação de proteínas fluorescentes dos efetores frequentemente bloqueia a secreção do efetor marcado e obstrui o T3SS¹⁴.

Além disso, as proteínas fluorescentes são menos estáveis e emitem um baixo número de fótons antes do fotoclareamento, limitando seu uso em técnicas microscópicas de super-resolução^16,17,18^, particularmente em microscopia de localização por fotoativação (PALM), STORM e microscopia de depleção de emissão estimulada (STED). Embora as propriedades fotofísicas dos corantes fluorescentes orgânicos sejam superiores às das proteínas fluorescentes, métodos/técnicas como CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 e HA-Tags^24,25 requerem uma proteína adicional ou apêndice peptídico que pode prejudicar a função-estrutura da proteína efetora de interesse^, interferindo com a modificação ou tráfico pós-traducional. Um método alternativo que minimiza a modificação proteica necessária envolve a incorporação de ncAAs em um POI durante a tradução através de GCE. Os ncAAs são fluorescentes ou podem ser tornados fluorescentes via click chemistry 12,13,26,27,28.

Usando GCE, ncAAs com grupos bio-ortogonais minúsculos, funcionais (como um grupo azida, ciclopropeno ou ciclooctyne) podem ser introduzidos em quase qualquer local em uma proteína-alvo. Nessa estratégia, um códon nativo é trocado por um códon raro, como um códon de parada âmbar (TAG) em uma posição especificada no gene do POI. A proteína modificada é subsequentemente expressa em células ao lado de um par ortogonal aminoacil-tRNA sintetase/tRNA. O sítio ativo da tRNA sintetase é projetado para receber apenas um ncAA particular, que é então ligado covalentemente à extremidade 3′ do tRNA que reconhece o códon âmbar. A ncAA é simplesmente introduzida no meio de crescimento, mas deve ser absorvida pela célula e chegar ao citosol, onde a aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) pode ligá-la ao RNAt ortogonal; em seguida, é incorporado ao POI no local especificado (ver Figura 1)¹². Assim, a ECG permite a incorporação sítio-específica de uma infinidade de grupos reativos bio-ortogonais como cetona, azida, alquina, ciclooctila, transcicloocteno, tetrazina, norboneno, α, amida β-insaturada e biciclo[6.1.0]-nonina em um POI, potencialmente superando as limitações dos métodos convencionais de marcação de proteínas 12,26,27,28.

Tendências recentes emergentes em técnicas de imagem de super-resolução abriram novos caminhos para investigar estruturas biológicas em nível molecular. Em particular, o STORM, uma técnica de super-resolução baseada em localização e molécula única, tornou-se uma ferramenta inestimável para visualizar estruturas celulares até ~20-30 nm e é capaz de investigar processos biológicos uma molécula de cada vez, descobrindo assim os papéis de moléculas intracelulares que ainda são desconhecidos em estudos tradicionais de média de conjunto¹³ . Técnicas de molécula única e super-resolução requerem uma pequena etiqueta com fluoróforos orgânicos brilhantes e fotoestáveis para a melhor resolução. Recentemente, demonstramos que a ECG pode ser usada para incorporar sondas adequadas para imagens de super-resolução¹².

Duas das melhores escolhas para marcação de proteínas em células são a biciclo[6.1.0] nonilisina (BCN) e a transciclooctena-lisina (TCO; mostrada na Figura 1), que podem ser codificadas geneticamente usando uma variante do par tRNA/sintetase (aqui denominado tRNA Pyl/PylRS AF), onde^Pyl representa pirrolisina, e^AF representa um mutante duplo racionalmente projetado (Y306A, Y384F) derivado de Methanosarcina mazei que codifica naturalmente pirrolisina ¹²^, 29,30,31. Através da reação de Diels-Alder (SPIEDAC) de demanda eletrônica inversa promovida por deformação, esses aminoácidos reagem quimoseletivamente com conjugados de tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tais reações de cicloadição são excepcionalmente rápidas e compatíveis com células vivas; Também podem ser fluorogênicos, se um fluoróforo apropriado for funcionalizado com a porção tetrazina^12,26,32. Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para monitorar a dinâmica de efetores bacterianos entregues em células hospedeiras usando GCE, seguido de localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando dSTORM. Os resultados indicam que a incorporação de uma ncAA via GCE, seguida por uma reação de clique com corantes fluorogênicos portadores de tetrazina, representa um método versátil para marcação seletiva, visualização de proteínas secretadas e subsequente localização subcelular no hospedeiro. Todos os componentes e procedimentos aqui detalhados, no entanto, podem ser ajustados ou substituídos para que o sistema GCE possa ser adaptado para investigar outras questões biológicas.

Protocol

1. Construção do plasmídeo Clone o gene que expressa o POI em um plasmídeo de expressão (por exemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expressa o POI em E. coli BL21 (DE3). Essa etapa facilita na determinação de que os mutantes são funcionais. Para a visualização de efetores secretados por Salmonella em células hospedeiras, construir-se um plasmídeo de expressão (pWSK29-sseJ-HA) que expresse o alvo POI SseJ sob o controle de seu promotor nativo, …

Representative Results

Este artigo de protocolo descreve um método baseado em GCE para marcação fluorescente sítio-específica e visualização de efetores secretados por Salmonella, como mostrado na Figura 1. A estrutura química do grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) e do corante fluorescente ncAA é mostrada na Figura 1A. A marcação de SseJ foi obtida pela incorporação genética de ncAAs bioortogonais em um códon de parada â…

Discussion

A abordagem aqui descrita foi utilizada para rastrear a localização precisa das proteínas efetoras injetadas na célula hospedeira pela bactéria T3SS após a infecção. T3SSs são empregados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella e Yersinia para transportar componentes de virulência para o hospedeiro. O desenvolvimento de tecnologias de imagem de super-resolução possibilitou a visualização de fatores de virulência com resolução antes inimaginável12,13,24.<sup clas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos de start-up da filial médica da Universidade do Texas, Galveston, TX, e um prêmio Texas STAR para L.J.K. Agradecemos ao Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Alemanha) pelo plasmídeo pEVOL-PylRS-AF. As imagens da Figura 1 foram criadas usando o BioRender.

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

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Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).