Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Moirangthem Kiran Singh; Linda J. Kenney

doi:10.3791/64382

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Biologia

आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके बैक्टीरियल स्रावित प्रोटीन की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Published: February 10, 2023

doi:

10.3791/64382

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

यह लेख आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करता है- विशेष रूप से और प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की छवि बनाता है।

Abstract

टाइप थ्री स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं के साइटोसोल में सीधे प्रभावक प्रोटीन की एक बैटरी इंजेक्ट करने में सक्षम बनाती है। प्रवेश पर, इंजेक्शन प्रभावक प्रोटीन सहकारी रूप से यूकेरियोटिक सिग्नलिंग मार्गों को संशोधित करते हैं और सेलुलर कार्यों को पुन: प्रोग्राम करते हैं, जिससे जीवाणु प्रवेश और अस्तित्व को सक्षम किया जा सकता है। संक्रमण के संदर्भ में इन स्रावित प्रभावक प्रोटीनों की निगरानी और स्थानीयकरण मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के गतिशील इंटरफ़ेस को परिभाषित करने के लिए एक पदचिह्न प्रदान करता है। हालांकि, मेजबान कोशिकाओं में उनकी संरचना / कार्य को बाधित किए बिना बैक्टीरिया प्रोटीन को लेबल करना और इमेजिंग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का निर्माण इस समस्या को हल नहीं करता है, क्योंकि संलयन प्रोटीन स्रावी तंत्र को जाम करते हैं और इस प्रकार स्रावित नहीं होते हैं। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) का उपयोग करके बैक्टीरिया स्रावित प्रभावकों के साथ-साथ अन्य कठिन-से-लेबल प्रोटीन के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए एक विधि नियोजित की। यह पेपर विशेष रूप से जीसीई साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक पूर्ण चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, इसके बाद प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की इमेजिंग के लिए निर्देश दिए जाते हैं।

हाल के निष्कर्ष बताते हैं कि जीसीई के माध्यम से गैर-कैननिकल अमीनो एसिड (एनसीएए) का समावेश, इसके बाद टेट्राज़िन युक्त रंगों के साथ बायो-ऑर्थोगोनल लेबलिंग, बैक्टीरिया स्रावित प्रोटीन के चयनात्मक लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन और मेजबान में बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य तकनीक है। इस लेख का लक्ष्य एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसे बैक्टीरिया और वायरस में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के साथ-साथ मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए जीसीई का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं द्वारा नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

बैक्टीरियल संक्रमण को लंबे समय से मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा माना जाता है। रोगजनक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने और संक्रमण ^1,2 स्थापित करने के लिए अत्यधिक विकसित, अत्यंत शक्तिशाली और जटिल रक्षा प्रणालियों के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के जीवाणु विषाणु कारकों (प्रभावक प्रोटीन के रूप में संदर्भित) का उपयोग करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों के अंतर्निहित आणविक तंत्र और व्यक्तिगत प्रभावक प्रोटीन की भूमिका अभी भी काफी हद तक अज्ञात है क्योंकि रोगजनन के दौरान मेजबान कोशिकाओं में महत्वपूर्ण प्रोटीन घटकों और प्रभावकों का सीधे पालन करने के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण की कमी है।

एक विशिष्ट उदाहरण साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिमुरियम है, जो तीव्र गैस्ट्रोएंटेराइटिस का कारण बनता है। साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम मेजबान कोशिकाओं में सीधे विभिन्न प्रकार के प्रभावक प्रोटीन इंजेक्ट करने के लिए टाइप तीन स्राव प्रणालियों (टी 3 एसएस) का उपयोग करता है। जैसे ही साल्मोनेला मेजबान कोशिका में प्रवेश करता है, यह एक अम्लीय झिल्ली-बाध्य डिब्बे में रहता है, जिसे साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (एससीवी) ^3,4 कहा जाता ^है। एससीवी का एसिड पीएच साल्मोनेला रोगजनकता द्वीप 2 (एसपीआई -2) -एन्कोडेड टी 3 एसएस को सक्रिय करता है और मेजबान साइटोसोल ^5,6,7,8 में वैक्यूलर झिल्ली में 20 या अधिक प्रभावकारक प्रोटीन ^की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करता है। मेजबान के अंदर, प्रभावक प्रोटीन के ये जटिल कॉकटेल समन्वय रूप से मेजबान सेल सिग्नलिंग मार्गों में हेरफेर करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एससीवी से विस्तारित अत्यधिक गतिशील, जटिल ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं का निर्माण होता है, जिसे साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स (एसआईएफ) कहा जाता है, जो साल्मोनेला को मेजबान कोशिकाओं ^9,10,11 के भीतर जीवित रहने और दोहराने में सक्षम बनाता ^है।

बैक्टीरियल प्रभावक स्थानीयकरण की कल्पना, ट्रैक और निगरानी करने के तरीके, और मेजबान कोशिकाओं के अंदर उनकी तस्करी और बातचीत की जांच करते हैं, जीवाणु रोगजनन को रेखांकित करने वाले तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। मेजबान कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला स्रावित टी 3 एसएस प्रभावक प्रोटीन का लेबलिंग और स्थानीयकरण एक तकनीकी चुनौती साबित हुआ है^12,13; बहरहाल, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास ने जीवित प्रणालियों के भीतर प्रोटीन का अध्ययन और कल्पना करने की हमारी क्षमता को बदल दिया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (~ 25-30 केडीए) ¹⁵ का आकार अक्सर रुचि के प्रोटीन (पीओआई; उदाहरण के लिए, एसएसएपी के लिए 13.65 केडीए, एसआईएफए के लिए 37.4 केडीए) के बराबर या उससे भी अधिक होता है। वास्तव में, प्रभावकों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग अक्सर लेबल किए गए प्रभावक के स्राव को अवरुद्ध करते हैं और टी 3 एसएस¹⁴ को जाम करते हैं।

इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन कम स्थिर होते हैं और फोटोब्लीचिंग से पहले कम संख्या में फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपिक^{तकनीकों 16,17,18} में उनका उपयोग सीमित हो जाता है, विशेष रूप से फोटोएक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), स्टॉर्म और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी में। जबकि कार्बनिक फ्लोरोसेंट रंगों के फोटोफिजिकल गुण फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बेहतर होते हैं, CLIP / SNAP^19,20, स्प्लिट-GFP ²¹, ReAsH / FLASH^22,23, और HA-Tags ^24,25 जैसे तरीकों / तकनीकों के लिए एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड उपांग की आवश्यकता होती है जो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन या तस्करी में हस्तक्षेप करके रुचि के प्रभावक प्रोटीन की संरचना-कार्य को खराब कर सकता है। एक वैकल्पिक विधि जो आवश्यक प्रोटीन संशोधन को कम करती है, उसमें जीसीई के माध्यम से अनुवाद के दौरान पीओआई में एनसीएए को शामिल करना शामिल है। एनसीएए या तो फ्लोरोसेंट हैं या क्लिक रसायन विज्ञान ^{12,13,26,27,28} के माध्यम से फ्लोरोसेंट बनाया जा सकता ^है।

जीसीई का उपयोग करके, छोटे, कार्यात्मक, जैव-ऑर्थोगोनल समूहों (जैसे एज़ाइड, साइक्लोप्रोपेन, या साइक्लोक्टाइन समूह) के साथ एनसीएए को लक्ष्य प्रोटीन में लगभग किसी भी स्थान पर पेश किया जा सकता है। इस रणनीति में, एक देशी कोडन को पीओआई के जीन में एक निर्दिष्ट स्थिति में एक एम्बर (टीएजी) स्टॉप कोडन जैसे दुर्लभ कोडन के साथ स्वैप किया जाता है। संशोधित प्रोटीन को बाद में एक ऑर्थोगोनल एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस / टीआरएनए जोड़ी के साथ कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। टीआरएनए सिंथेटेस सक्रिय साइट को केवल एक विशेष एनसीएए प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो तब टीआरएनए के 3′-अंत से सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है जो एम्बर कोडन को पहचानता है। एनसीएए को बस विकास माध्यम में पेश किया जाता है, लेकिन इसे सेल द्वारा लिया जाना चाहिए और साइटोसोल तक पहुंचना चाहिए जहां एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस (एएआरएस) इसे ऑर्थोगोनल टीआरएनए से जोड़ सकता है; फिर इसे निर्दिष्ट स्थान पर पीओआई में शामिल किया जाता है (चित्र 1)¹² देखें)। इस प्रकार, जीसीई बायो-ऑर्थोगोनल प्रतिक्रियाशील समूहों जैसे कि कीटोन, एज़ाइड, एल्केन, साइक्लोक्टाइन, ट्रांससाइक्लोक्लॉक्टिन, टेट्राज़िन, नॉरबोनेन, α, β-असंतृप्त एमाइड, और बाइसाइक्लो [6.1.0]-नॉनाइन को पीओआई में शामिल करने में सक्षम बनाता है, जो संभावित रूप से पारंपरिक प्रोटीन लेबलिंग विधियों^12,26,27,28 की सीमाओं पर काबू पा लेता है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों में हाल के उभरते रुझानों ने आणविक स्तर पर जैविक संरचनाओं की जांच करने के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं। विशेष रूप से, स्टॉर्म, एक एकल-अणु, स्थानीयकरण-आधारित, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, ~ 20-30 एनएम तक सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है और एक समय में एक अणु की जैविक प्रक्रियाओं की जांच करने में सक्षम है, जिससे इंट्रासेल्युलर अणुओं की भूमिकाओं की खोज होती है जो पारंपरिक पहनावा-औसत^{अध्ययनों} में अभी तक अज्ञात हैं। . एकल-अणु और सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को सर्वोत्तम रिज़ॉल्यूशन के लिए उज्ज्वल, फोटोटेबल कार्बनिक फ्लोरोफोरेस के साथ एक छोटे टैग की आवश्यकता होती है। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि जीसीई का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग¹² के लिए उपयुक्त जांच को शामिल करने के लिए किया जा सकता है।

कोशिकाओं में प्रोटीन लेबलिंग के लिए दो सबसे अच्छे विकल्प बाइसाइक्लो [6.1.0] नॉनयनेलिसिन (बीसीएन) और ट्रांस-साइक्लोएक्टिन-लाइसिन (टीसीओ; चित्रा 1 में दिखाए गए) हैं, जिन्हें आनुवंशिक रूप से टीआरएनए / सिंथेटेस जोड़ी के एक संस्करण का उपयोग करके एन्कोड किया जा सकता है (जिसे यहां टीआरएनए^पाइल / पाइलआरएस^एएफ कहा जाता है), जहां पाइल पाइरोलिसिन का प्रतिनिधित्व करता है, और एएफ एक तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन किए गए डबल म्यूटेंट (वाई 306 ए, वाई 384 एफ) का प्रतिनिधित्व करता है जो स्वाभाविक रूप से मेथानोसिन से प्राप्त होता है^। 29,30,31. तनाव-प्रचारित व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन-मांग डाइल्स-एल्डर साइक्लोडिशन (एसपीआईईडीएसी) प्रतिक्रिया के माध्यम से, ये अमीनो एसिड टेट्राज़िन संयुग्म (चित्रा 1) ^12,30,31 के साथ केमोसेलेक्टिव रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। इस तरह की साइक्लोडिशन प्रतिक्रियाएं असाधारण रूप से तेज और जीवित कोशिकाओं के साथ संगत हैं; वे फ्लोरोजेनिक भी हो सकते हैं, अगर एक उपयुक्त फ्लोरोफोरे को टेट्राज़िन मोइटी^12,26,32 के साथ कार्यात्मक किया जाता है। यह पेपर जीसीई का उपयोग करके मेजबान कोशिकाओं में वितरित जीवाणु प्रभावकों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, इसके बाद डीएसटीआरएम का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण होता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि जीसीई के माध्यम से एक एनसीएए का समावेश, इसके बाद फ्लोरोजेनिक टेट्राज़िन-असर रंगों के साथ एक क्लिक प्रतिक्रिया, चयनात्मक लेबलिंग, स्रावित प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन और बाद में मेजबान में उप-सेलुलर स्थानीयकरण के लिए एक बहुमुखी विधि का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, यहां विस्तृत सभी घटकों और प्रक्रियाओं को समायोजित या प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि जीसीई प्रणाली को अन्य जैविक प्रश्नों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सके।

Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण पीओआई को व्यक्त करने वाले जीन को एक अभिव्यक्ति प्लास्मिड (जैसे, पीईटी 28 ए-एसएसईजे10टीएजी) में क्लोन करें जो ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) में पीओआई को व्यक्त करता है। यह कदम यह न?…

Representative Results

यह प्रोटोकॉल पेपर साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग और साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक जीसीई-आधारित विधि का वर्णन करता है, जैसा कि चित्र 1 में दर्शा?…

Discussion

यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग संक्रमण के बाद बैक्टीरियल टी 3 एसएस द्वारा मेजबान सेल में इंजेक्ट किए गए प्रभावक प्रोटीन के सटीक स्थान को ट्रैक करने के लिए किया गया था। टी 3 एसएस को इंट्रासेल्युलर रोगजन?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को टेक्सास मेडिकल शाखा, गैलवेस्टन, टेक्सास विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंड और एलजेके को टेक्सास स्टार पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। एडवर्ड लेमके (यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला, हीडलबर्ग, जर्मनी) को प्लास्मिड पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ के लिए धन्यवाद देते हैं। चित्रा 1 में छवियां बायोरेंडर का उपयोग करके बनाई गई थीं।

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

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Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).