Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l’espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All’ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l’ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un’impronta per definire l’interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l’etichettatura e l’imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.
La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l’apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l’espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l’imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
Recenti scoperte suggeriscono che l’incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell’ospite. L’obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.
Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell’ospite e stabilire infezioni 1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle cellule ospiti durante la patogenesi.
Un esempio tipico è Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che causa gastroenterite acuta. Salmonella Typhimurium utilizza sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) per iniettare una varietà di proteine effettrici direttamente nelle cellule ospiti. Non appena la Salmonella entra nella cellula ospite, risiede in un compartimento legato alla membrana acida, chiamato vacuolo contenente Salmonella (SCV)3,4. Il pH acido dell’SCV attiva il T3SS codificato per l’isola di patogenicità della Salmonella 2 (SPI-2) e trasloca una raffica di 20 o più proteine effettrici attraverso la membrana vacuolare nel citosol ospite 5,6,7,8. All’interno dell’ospite, questi complessi cocktail di proteine effettrici manipolano coordinatamente le vie di segnalazione delle cellule ospiti, con conseguente formazione di strutture di membrana tubulari altamente dinamiche e complesse estese dall’SCV lungo i microtubuli, chiamati filamenti indotti da Salmonella (SIF), che consentono alla Salmonella di sopravvivere e replicarsi all’interno delle cellule ospiti 9,10,11.
I metodi per visualizzare, tracciare e monitorare le localizzazioni degli effettori batterici ed esaminare il loro traffico e le interazioni all’interno delle cellule ospiti, forniscono informazioni critiche sui meccanismi alla base della patogenesi batterica. La marcatura e la localizzazione delle proteine effettrici T3SS secrete da Salmonella all’interno delle cellule ospiti si è dimostrata una sfida tecnologica12,13; Tuttavia, lo sviluppo di proteine fluorescenti codificate geneticamente ha trasformato la nostra capacità di studiare e visualizzare le proteine all’interno dei sistemi viventi. Tuttavia, la dimensione delle proteine fluorescenti (~25-30 kDa)15 è spesso paragonabile o addirittura superiore a quella della proteina di interesse (POI; ad esempio, 13,65 kDa per SsaP, 37,4 kDa per SifA). Infatti, la marcatura fluorescente delle proteine degli effettori spesso blocca la secrezione dell’effettore marcato e blocca il T3SS14.
Inoltre, le proteine fluorescenti sono meno stabili ed emettono un basso numero di fotoni prima del fotosbiancamento, limitando il loro uso nelle tecniche microscopiche a super-risoluzione16,17,18, in particolare nella microscopia di localizzazione della fotoattivazione (PALM), STORM e microscopia STED (stimolation emission depletion). Mentre le proprietà fotofisiche dei coloranti fluorescenti organici sono superiori a quelle delle proteine fluorescenti, metodi / tecniche come CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 e HA-Tags 24,25 richiedono un’appendice proteica o peptidica aggiuntiva che può compromettere la struttura-funzione della proteina effettrice di interesse interferendo con la modifica o il traffico post-traduzionale. Un metodo alternativo che riduce al minimo la necessaria modificazione proteica comporta l’incorporazione di ncAA in un POI durante la traduzione attraverso GCE. Gli ncAA sono fluorescenti o possono essere resi fluorescenti tramite chimica a scatto 12,13,26,27,28.
Utilizzando la GCE, le ncAA con gruppi piccoli, funzionali, bio-ortogonali (come un gruppo azide, ciclopropene o cicloottino) possono essere introdotte in quasi tutte le posizioni in una proteina bersaglio. In questa strategia, un codone nativo viene scambiato con un codone raro come un codone di arresto ambrato (TAG) in una posizione specifica nel gene del POI. La proteina modificata viene successivamente espressa nelle cellule insieme a una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA. Il sito attivo della tRNA sintetasi è progettato per ricevere solo un particolare ncAA, che viene quindi attaccato covalentemente all’estremità 3′ del tRNA che riconosce il codone ambrato. L’ncAA viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita, ma deve essere assorbito dalla cellula e raggiungere il citosol dove l’amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) può collegarlo al tRNA ortogonale; viene quindi incorporato nel PDI nella posizione specificata (vedere Figura 1)12. Pertanto, GCE consente l’incorporazione sito-specifica di una pletora di gruppi reattivi bio-ortogonali come chetone, azide, alchino, cicloottino, transciclooctene, tetrazina, norbonene, α, ammide β-insatura e biciclo [6.1.0]-nonyne in un POI, superando potenzialmente i limiti dei metodi convenzionali di etichettatura delle proteine 12,26,27,28.
Le recenti tendenze emergenti nelle tecniche di imaging a super-risoluzione hanno aperto nuove strade per studiare le strutture biologiche a livello molecolare. In particolare, STORM, una tecnica a super-risoluzione basata sulla localizzazione, è diventata uno strumento inestimabile per visualizzare strutture cellulari fino a ~ 20-30 nm ed è in grado di studiare i processi biologici una molecola alla volta, scoprendo così i ruoli delle molecole intracellulari che sono ancora sconosciuti negli studi tradizionali con media di ensemble13 . Le tecniche a singola molecola e super-risoluzione richiedono un piccolo tag con fluorofori organici luminosi e fotostabili per la migliore risoluzione. Abbiamo recentemente dimostrato che GCE può essere utilizzato per incorporare sonde adatte per l’imaging a super-risoluzione12.
Due delle migliori scelte per la marcatura delle proteine nelle cellule sono biciclo [6.1.0] noninilisina (BCN) e trans-ciclooctene-lisina (TCO; mostrato in Figura 1), che può essere geneticamente codificato usando una variante della coppia tRNA/sintetasi (qui chiamata tRNAPyl/PylRS AF), dove Pyl rappresenta la pirrolisina, e AF rappresenta un doppio mutante razionalmente progettato (Y306A, Y384F) derivato da Methanosarcina mazei che codifica naturalmente la pirrolisina12, 29,30,31. Attraverso la reazione di cicloaddizione di Diels-Alder (SPIEDAC) promossa dalla tensione inversa, questi amminoacidi reagiscono chesomelettivamente con i coniugati tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tali reazioni di cicloaddizione sono eccezionalmente veloci e compatibili con le cellule viventi; Possono anche essere fluorogenici, se un fluoroforo appropriato è funzionalizzato con la porzione di tetrazina12,26,32. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della dinamica degli effettori batterici consegnati nelle cellule ospiti utilizzando GCE, seguito dalla localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando dSTORM. I risultati indicano che l’incorporazione di un ncAA tramite GCE, seguita da una reazione a clic con coloranti fluorogenici contenenti tetrazina, rappresenta un metodo versatile per la marcatura selettiva, la visualizzazione delle proteine secrete e la successiva localizzazione subcellulare nell’ospite. Tutti i componenti e le procedure qui descritti possono tuttavia essere adattati o sostituiti in modo che il sistema GCE possa essere adattato per indagare su altre questioni biologiche.
L’approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l’infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell’ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile12,13,24</s…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da fondi di start-up della University of Texas Medical branch, Galveston, TX, e un premio Texas STAR a L.J.K. Ringraziamo il Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania) per il plasmide pEVOL-PylRS-AF. Le immagini nella Figura 1 sono state create utilizzando BioRender.
10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |