Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

Summary

Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Abstract

I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All'ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l'ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un'impronta per definire l'interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l'etichettatura e l'imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.

La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l'apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l'imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)

Recenti scoperte suggeriscono che l'incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell'ospite. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.

Introduction

Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell'ospite e stabilire infezioni ^1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle....

Protocol

1. Costruzione plasmidica

1. Clonare il gene che esprime il POI in un plasmide di espressione (ad esempio, pET28a-sseJ 10TAG) che esprime il POI in E. coli BL21 (DE3). Questo passaggio facilita nel determinare che i mutanti sono funzionali.
2. Per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, costruire un plasmide di espressione (pWSK29-sseJ-HA) che esprima il POI bersaglio SseJ sotto il controllo del suo promotore nativo, come descritto nei precedenti rapporti ^7,12,24. Utilizz....

Results

Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l'etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di n.......

Discussion

L'approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l'infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell'ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile^12,13,24

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glicina SDS tampone di corsa	BIO-RAD	1610732
Cloruro di ammonio	Fischer Scientific	A661-500
Solfato di ammonio	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillina Sodica	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotico-Antimicotico (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinosio	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (Centrifuga ad alte prestazioni)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazina	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoetanolo	Millipore	444203	250 mL
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Caseina	Sigma-Aldrich	C8654
Catalasi	Sigma-Aldrich	C9322
Cloramfenicolo	Sigma-Aldrich	C1919
Fare clic sull'aminoacido / trans-Cyclooct-2-en – L - Lisina (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Formato: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Spettrofotometro Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV*	Utilizzato per il mantenimento di HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Utilizzato per l'infezione batterica in presenza di ncAA, vedere paragrafo 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Asino anti-coniglio Alexa fluoro555 anticorpo secondario	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
Ceppo E. coli BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Amburgo, Germania	30123.328
Siero fetale bovino (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand - Sterili (PVDF 0,22 &; micro; m)	Fischer Scientific	97203	Confezione da 100
Gene Pulser Xcell Elettroporatore	BIO-RAD	1652660
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutammina (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glicerolo	Fischer Scientifico	BF229-4
Cellule HeLa	ATTC	CCL-2
HEPES Tampone	Corning	25-060-C1	100 mL
Acido cloridrico	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Elaborazione e analisi delle immagini:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Colorante a base di Coomassie
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazina	Tocris Bioscience	7279
Kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Brodo	BD Difco	244620	500 g
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876
μ Manager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Cuvetta per micropulsatore	BIO-RAD	165-2086	0,2 cm distanza tra gli elettrodi, confezione da 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Fiasche per colture cellulari	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Microscopia elettronica Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			Per la costruzione e la mappa del plasmide vedere i seguenti riferimenti 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Kit di mini-preparazione del plasmide	Qiagen	27106
plasmide pWSK29-sseJ10TAG-HA			Rif.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmide pWSK29-sseJ-HA			Rif.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                                                                                    Mappa vettoriale di PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	grado proteico, soluzione al 10%
Fosfato di potassio monobasico	Fischer Scientific	P285-500
Solfato di potassio	Acros Inibitore organico	della
Cocktail Set I - Soluzione Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x
Anticorpo primario anti-HA di coniglio	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. sierotipo Typhimurium 14028s			Rif.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponina	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Idrossido di sodio	Fischer Scientific	SS255-1
Piruvato di sodio (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Smembratore sonico Modello 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (sistema Leica TCS SP8 STED 3X)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tripsina-EDTA (1x), 0,25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well vetrini per camera di coltura tissutale	SARSTEDT	94.6190.802