Denne artikkelen gir en enkel og klar protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av genetisk kodeutvidelse (GCE) stedsspesifikt og avbilde subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved hjelp av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)
Type tre sekresjonssystemer (T3SS) gjør det mulig for gramnegative bakterier å injisere et batteri av effektorproteiner direkte inn i cytosolen til eukaryote vertsceller. Ved innreise modulerer de injiserte effektorproteinene eukaryote signalveier og omprogrammerer cellulære funksjoner, noe som muliggjør bakteriell oppføring og overlevelse. Overvåking og lokalisering av disse utskilte effektorproteinene i sammenheng med infeksjoner gir et fotavtrykk for å definere det dynamiske grensesnittet for vertspatogeninteraksjoner. Imidlertid er merking og avbildning av bakterielle proteiner i vertsceller uten å forstyrre deres struktur / funksjon teknisk utfordrende.
Konstruksjon av fluorescerende fusjonsproteiner løser ikke dette problemet, fordi fusjonsproteinene jammer sekretoriske apparater og dermed ikke utskilles. For å overvinne disse hindringene brukte vi nylig en metode for stedsspesifikk fluorescerende merking av bakterielle utskillede effektorer, så vel som andre vanskelig å merke proteiner, ved bruk av genetisk kodeutvidelse (GCE). Dette papiret gir en komplett trinnvis protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av GCE-spesifikt, etterfulgt av instruksjoner for avbildning av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)
Nylige funn tyder på at inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via GCE, etterfulgt av bio-ortogonal merking med tetrazinholdige fargestoffer, er en levedyktig teknikk for selektiv merking og visualisering av bakterielle utskillede proteiner og påfølgende bildeanalyse i verten. Målet med denne artikkelen er å gi en enkel og klar protokoll som kan brukes av etterforskere som er interessert i å gjennomføre superoppløsningsavbildning ved hjelp av GCE for å studere ulike biologiske prosesser i bakterier og virus, samt vertspatogeninteraksjoner.
Bakterielle infeksjoner har lenge vært ansett som en alvorlig fare for menneskers helse. Patogener bruker høyt utviklede, ekstremt kraftige og intrikate forsvarssystemer, samt en rekke bakterielle virulensfaktorer (referert til som effektorproteiner) for å unngå vertsimmunresponser og etablere infeksjoner 1,2. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse systemene og rollen til individuelle effektorproteiner fortsatt stort sett ukjente på grunn av mangelen på egnede tilnærminger for direkte å følge de avgjørende proteinkomponentene og effektorene i vertsceller under patogenesen.
Et typisk eksempel er Salmonella enterica serovar Typhimurium, som forårsaker akutt gastroenteritt. Salmonella Typhimurium bruker type tre sekresjonssystemer (T3SS) for å injisere en rekke effektorproteiner direkte inn i vertsceller. Så snart Salmonella kommer inn i vertscellen, ligger den i et surt membranbundet rom, kalt Salmonella-inneholdende vakuol (SCV) 3,4. Den sure pH i SCV aktiverer Salmonella patogenisitet øya 2 (SPI-2)-kodet T3SS og translokerer en volley av 20 eller flere effektorproteiner over vakuolar membranen inn i verten cytosol 5,6,7,8. Inne i verten manipulerer disse komplekse cocktailer av effektorproteiner koordinat vertscellesignalveier, noe som resulterer i dannelsen av svært dynamiske, komplekse rørformede membranstrukturer utvidet fra SCV langs mikrotubuli, kalt Salmonella-induserte filamenter (SIF), som gjør det mulig for Salmonella å overleve og replikere i vertscellene9,10,11.
Metoder for å visualisere, spore og overvåke bakterielle effektorlokaliseringer, og undersøke deres handel og interaksjoner i vertsceller, gir kritisk innsikt i mekanismene som ligger til grunn for bakteriell patogenese. Merking og lokalisering av Salmonella-utskilte T3SS-effektorproteiner inne i vertsceller har vist seg å være en teknologisk utfordring12,13; Ikke desto mindre har utviklingen av genetisk kodede fluorescerende proteiner forvandlet vår evne til å studere og visualisere proteiner i levende systemer. Imidlertid er størrelsen på fluorescerende proteiner (~ 25-30 kDa) 15 ofte sammenlignbar med eller enda større enn proteinet av interesse (POI; f.eks. 13,65 kDa for SsaP, 37,4 kDa for SifA). Faktisk blokkerer fluorescerende proteinmerking av effektorer ofte sekresjonen av den merkede effektoren og syltetøy T3SS14.
Videre er fluorescerende proteiner mindre stabile og avgir et lavt antall fotoner før fotobleking, noe som begrenser bruken i superoppløsningsmikroskopiske teknikker16,17,18, spesielt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Mens de fotofysiske egenskapene til organiske fluorescerende fargestoffer er bedre enn fluorescerende proteiner, krever metoder/teknikker som CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 og HA-Tags 24,25 et ekstra protein- eller peptidvedheng som kan svekke strukturfunksjonen til effektorproteinet av interesse ved å forstyrre posttranslasjonell modifikasjon eller handel. En alternativ metode som minimerer nødvendig proteinmodifisering innebærer inkorporering av ncAAs i et POI under oversettelse gjennom GCE. NCAene er enten fluorescerende eller kan gjøres fluorescerende via klikkkjemi 12,13,26,27,28.
Ved hjelp av GCE kan ncAAs med små, funksjonelle, bio-ortogonale grupper (som en azid-, cyklopropen- eller cyklooktynegruppe) introduseres på nesten hvilket som helst sted i et målprotein. I denne strategien byttes et innfødt kodon med et sjeldent kodon som et gult (TAG) stoppkodon i en spesifisert posisjon i genet til POI. Det modifiserte proteinet uttrykkes deretter i celler sammen med et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase / tRNA-par. Det aktive tRNA-syntetase-stedet er designet for å motta bare en bestemt ncAA, som deretter er kovalent festet til 3′-enden av tRNA som gjenkjenner det gule kodonet. ncAA blir ganske enkelt introdusert i vekstmediet, men det må tas opp av cellen og nå cytosolen der aminoacyl-tRNA-syntetasen (aaRS) kan koble den til det ortogonale tRNA; den blir deretter innlemmet i POI på det angitte stedet (se figur 1)12. Dermed muliggjør GCE stedsspesifikk inkorporering av en mengde bio-ortogonale reaktive grupper som keton, azid, alkyn, cyklooktin, transsyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-umettet amid og bicyclo [6.1.0]-nonyne i en POI, potensielt overvinne begrensningene i konvensjonelle proteinmerkingsmetoder 12,26,27,28.
Nylige fremvoksende trender i superoppløsningsbildebehandlingsteknikker har åpnet nye veier for å undersøke biologiske strukturer på molekylært nivå. Spesielt har STORM, en enkeltmolekylær, lokaliseringsbasert, superoppløsningsteknikk, blitt et uvurderlig verktøy for å visualisere cellulære strukturer ned til ~ 20-30 nm og er i stand til å undersøke biologiske prosesser ett molekyl om gangen, og dermed oppdage rollene til intracellulære molekyler som ennå er ukjente i tradisjonelle ensemble-gjennomsnittlige studier13 . Enkeltmolekylære og superoppløsningsteknikker krever en liten tag med lyse, fotostabile organiske fluoroforer for best oppløsning. Vi har nylig demonstrert at GCE kan brukes til å inkorporere egnede sonder for superoppløsningsavbildning12.
To av de beste valgene for proteinmerking i celler er bicyclo [6.1.0] nonynelysin (BCN) og trans-cyklookten-lysin (TCO; vist i figur 1), som kan være genetisk kodet ved hjelp av en variant av tRNA / syntetaseparet (her kalt tRNA Pyl/PylRSAF), hvorPyl representerer pyrrolysin, og AF representerer en rasjonelt utformet dobbeltmutant (Y306A, Y384F) avledet fra Methanosarcina mazei som naturlig koder for pyrrolysin12, 29,30,31. Gjennom den belastningsfremmende inverse Diels-Alder-sykloaddisjonsreaksjonen (SPIEDAC) reagerer disse aminosyrene kjemoselektivt med tetrazinkonjugater (figur 1)12,30,31. Slike sykloaddisjonsreaksjoner er eksepsjonelt raske og kompatible med levende celler; De kan også være fluorogene, hvis en passende fluorofor er funksjonalisert med tetrazindelen12,26,32. Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll for overvåking av dynamikken til bakterielle effektorer levert inn i vertsceller ved hjelp av GCE, etterfulgt av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av dSTORM. Resultatene indikerer at inkorporering av en ncAA via GCE, etterfulgt av en klikkreaksjon med fluorogene tetrazinbærende fargestoffer, representerer en allsidig metode for selektiv merking, visualisering av utskilte proteiner og påfølgende subcellulær lokalisering i verten. Alle komponentene og prosedyrene som er beskrevet her, kan imidlertid justeres eller erstattes slik at GCE-systemet kan tilpasses for å undersøke andre biologiske spørsmål.
Tilnærmingen beskrevet her ble brukt til å spore den nøyaktige plasseringen av effektorproteiner injisert i vertscellen av bakterien T3SS etter infeksjon. T3SS er ansatt av intracellulære patogener som Salmonella, Shigella og Yersinia for å transportere virulenskomponenter inn i verten. Utviklingen av superoppløsningsteknologier har gjort det mulig å visualisere virulensfaktorer ved en tidligere utenkelig oppløsning12,13,24…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra University of Texas Medical branch, Galveston, TX, og en Texas STAR-pris til LJK Vi takker professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) for plasmid pEVOL-PylRS-AF. Bildene i figur 1 ble laget ved hjelp av BioRender.
10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |