Denna artikel ger ett enkelt och tydligt protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med hjälp av genetisk kodutvidgning (GCE) platsspecifikt och avbilda den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)
Typ tre sekretionssystem (T3SS) gör det möjligt för gramnegativa bakterier att injicera ett batteri av effektorproteiner direkt i cytosolen hos eukaryota värdceller. Vid inträde modulerar de injicerade effektorproteinerna tillsammans eukaryota signalvägar och omprogrammerar cellulära funktioner, vilket möjliggör bakterieinträde och överlevnad. Övervakning och lokalisering av dessa utsöndrade effektorproteiner i samband med infektioner ger ett fotavtryck för att definiera det dynamiska gränssnittet för värd-patogeninteraktioner. Att märka och avbilda bakterieproteiner i värdceller utan att störa deras struktur / funktion är dock tekniskt utmanande.
Att konstruera fluorescerande fusionsproteiner löser inte detta problem, eftersom fusionsproteinerna fastnar i sekretionsapparaten och därmed inte utsöndras. För att övervinna dessa hinder använde vi nyligen en metod för platsspecifik fluorescerande märkning av bakteriella utsöndrade effektorer, liksom andra svårmärkta proteiner, med hjälp av genetisk kodexpansion (GCE). Detta dokument ger ett komplett steg-för-steg-protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med GCE-platsspecifikt, följt av anvisningar för avbildning av den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)
Nya fynd tyder på att införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAA) via GCE, följt av bio-ortogonal märkning med tetrazininnehållande färgämnen, är en livskraftig teknik för selektiv märkning och visualisering av bakteriella utsöndrade proteiner och efterföljande bildanalys i värden. Målet med denna artikel är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan användas av utredare som är intresserade av att genomföra superupplösningsavbildning med GCE för att studera olika biologiska processer i bakterier och virus samt värd-patogeninteraktioner.
Bakteriella infektioner har länge betraktats som en allvarlig fara för människors hälsa. Patogener använder högt utvecklade, extremt kraftfulla och invecklade försvarssystem, liksom en mängd olika bakteriella virulensfaktorer (kallade effektorproteiner) för att undvika värdimmunsvar och etablera infektioner 1,2. De molekylära mekanismerna bakom dessa system och rollen för enskilda effektorproteiner är dock fortfarande till stor del okända på grund av bristen på lämpliga metoder för att direkt följa de avgörande proteinkomponenterna och effektorerna i värdceller under patogenes.
Ett typiskt exempel är Salmonella enterica serovar Typhimurium, som orsakar akut gastroenterit. Salmonella Typhimurium använder typ tre sekretionssystem (T3SS) för att injicera en mängd olika effektorproteiner direkt i värdceller. Så snart Salmonella kommer in i värdcellen finns den i ett surt membranbundet fack, kallat Salmonella-innehållande vakuol (SCV)3,4. SCV: s sura pH aktiverar Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodad T3SS och translokerar en volley av 20 eller fler effektorproteiner över det vakuolära membranet till värdcytosolen 5,6,7,8. Inuti värden manipulerar dessa komplexa cocktails av effektorproteiner koordinerat värdcellens signalvägar, vilket resulterar i bildandet av mycket dynamiska, komplexa rörformiga membranstrukturer utsträckta från SCV längs mikrotubuli, benämnda Salmonella-inducerade filament (SIF), som gör det möjligt för Salmonella att överleva och replikera inom värdcellerna9,10,11.
Metoder för att visualisera, spåra och övervaka lokaliseringar av bakteriella effektorer och undersöka deras handel och interaktioner inuti värdceller ger kritisk inblick i mekanismerna som ligger till grund för bakteriell patogenes. Märkning och lokalisering av Salmonella-utsöndrade T3SS-effektorproteiner inuti värdceller har visat sig vara en teknisk utmaning12,13; Ändå har utvecklingen av genetiskt kodade fluorescerande proteiner förändrat vår förmåga att studera och visualisera proteiner inom levande system. Storleken på fluorescerande proteiner (~ 25-30 kDa)15 är emellertid ofta jämförbar med eller till och med större än den för proteinet av intresse (POI; t.ex. 13,65 kDa för SsaP, 37,4 kDa för SifA). Faktum är att fluorescerande proteinmärkning av effektorer ofta blockerar utsöndringen av den märkta effektorn och fastnar T3SS14.
Dessutom är fluorescerande proteiner mindre stabila och avger ett lågt antal fotoner före fotoblekning, vilket begränsar deras användning i superupplösningsmikroskopiska tekniker16,17,18, särskilt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Medan de fotofysiska egenskaperna hos organiska fluorescerande färgämnen är överlägsna de hos fluorescerande proteiner, kräver metoder/tekniker som CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 och HA-Tags 24,25 ytterligare ett protein- eller peptidbihang som kan försämra strukturfunktionen hos effektorproteinet av intresse genom att störa posttranslationell modifiering eller handel. En alternativ metod som minimerar nödvändig proteinmodifiering innefattar införlivande av ncAA i en POI under översättning genom GCE. NCAAs är antingen fluorescerande eller kan göras fluorescerande via klickkemi 12,13,26,27,28.
Med hjälp av GCE kan ncAA med små, funktionella, bioortogonala grupper (såsom en azid-, cyklopropen- eller cyklooktyngrupp) introduceras på nästan vilken plats som helst i ett målprotein. I denna strategi byts ett naturligt kodon ut mot ett sällsynt kodon, såsom ett bärnsten (TAG) stoppkodon vid en angiven position i POI-genen. Det modifierade proteinet uttrycks därefter i celler tillsammans med ett ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetas/tRNA-par. Det aktiva stället för tRNA-syntetas är utformat för att endast ta emot en viss ncAA, som sedan är kovalent fäst vid 3′-änden av tRNA som känner igen bärnstenskodonet. NCAA införs helt enkelt i tillväxtmediet, men det måste tas upp av cellen och nå cytosolen där aminoacyl-tRNA-syntetas (aaRS) kan länka det till det ortogonala tRNA; Den införlivas sedan i intressepunkten på den angivna platsen (se figur 1)12. Således möjliggör GCE platsspecifik införlivande av en uppsjö av bio-ortogonala reaktiva grupper såsom keton, azid, alkyn, cyklooktyn, transcyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-omättad amid och bicyklo [6.1.0]-nonyn i en POI, vilket potentiellt kan övervinna begränsningarna för konventionella proteinmärkningsmetoder 12,26,27,28.
De senaste framväxande trenderna inom superupplösningsavbildningstekniker har öppnat nya vägar för att undersöka biologiska strukturer på molekylär nivå. I synnerhet har STORM, en enmolekylär, lokaliseringsbaserad, superupplösningsteknik, blivit ett ovärderligt verktyg för att visualisera cellulära strukturer ner till ~ 20-30 nm och kan undersöka biologiska processer en molekyl i taget och därigenom upptäcka rollerna för intracellulära molekyler som ännu är okända i traditionella ensemble-genomsnittliga studier13 . Enmolekyl- och superupplösningstekniker kräver en liten tagg med ljusa, fotostabila organiska fluoroforer för bästa upplösning. Vi visade nyligen att GCE kan användas för att införliva lämpliga prober för superupplösningsavbildning12.
Två av de bästa valen för proteinmärkning i celler är bicyklisk [6.1.0] nonynelysin (BCN) och transcyklookten-lysin (TCO; visas i figur 1), som kan kodas genetiskt med hjälp av en variant av tRNA / syntetasparet (här benämnt tRNA Pyl / PylRS AF), därPyl representerar pyrrolysin, ochAF representerar en rationellt utformad dubbelmutant (Y306A, Y384F) härledd från Methanosarcina mazei som naturligt kodar för pyrrolysin12, 29,30,31. Genom den stamfrämjade inversa elektronbehovsreaktionen Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) reagerar dessa aminosyror kemoselektivt med tetrazinkonjugat (figur 1) 12,30,31. Sådana cykloadditionsreaktioner är exceptionellt snabba och kompatibla med levande celler; De kan också vara fluorogena om en lämplig fluorofor funktionaliseras med tetrazindelen12,26,32. Detta dokument presenterar ett optimerat protokoll för övervakning av dynamiken hos bakteriella effektorer som levereras till värdceller med GCE, följt av subcellulär lokalisering av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med dSTORM. Resultaten indikerar att inkorporering av en ncAA via GCE, följt av en klickreaktion med fluorogena tetrazinbärande färgämnen, representerar en mångsidig metod för selektiv märkning, visualisering av utsöndrade proteiner och efterföljande subcellulär lokalisering i värden. Alla komponenter och procedurer som beskrivs här kan dock justeras eller ersättas så att GCE-systemet kan anpassas för att undersöka andra biologiska frågor.
Tillvägagångssättet som beskrivs här användes för att spåra den exakta platsen för effektorproteiner som injicerades i värdcellen av bakteriella T3SS efter infektion. T3SS används av intracellulära patogener såsom Salmonella, Shigella och Yersinia för att transportera virulenskomponenter in i värden. Utvecklingen av superupplösningsbildteknik har gjort det möjligt att visualisera virulensfaktorer med en tidigare ofattbar upplösning12,13,24<sup…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av startfonder från University of Texas Medical branch, Galveston, TX och ett Texas STAR-pris till JK. Vi tackar professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) för plasmiden pEVOL-PylRS-AF. Bilderna i figur 1 skapades med BioRender.
10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |