Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Moirangthem Kiran Singh; Linda J. Kenney

doi:10.3791/64382

JoVE Journal > Biology

Biologia

Superoppløsningsavbildning av bakterielle utskillede proteiner ved hjelp av genetisk kodeutvidelse

Published: February 10, 2023

doi:

10.3791/64382

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

Denne artikkelen gir en enkel og klar protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av genetisk kodeutvidelse (GCE) stedsspesifikt og avbilde subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved hjelp av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)

Abstract

Type tre sekresjonssystemer (T3SS) gjør det mulig for gramnegative bakterier å injisere et batteri av effektorproteiner direkte inn i cytosolen til eukaryote vertsceller. Ved innreise modulerer de injiserte effektorproteinene eukaryote signalveier og omprogrammerer cellulære funksjoner, noe som muliggjør bakteriell oppføring og overlevelse. Overvåking og lokalisering av disse utskilte effektorproteinene i sammenheng med infeksjoner gir et fotavtrykk for å definere det dynamiske grensesnittet for vertspatogeninteraksjoner. Imidlertid er merking og avbildning av bakterielle proteiner i vertsceller uten å forstyrre deres struktur / funksjon teknisk utfordrende.

Konstruksjon av fluorescerende fusjonsproteiner løser ikke dette problemet, fordi fusjonsproteinene jammer sekretoriske apparater og dermed ikke utskilles. For å overvinne disse hindringene brukte vi nylig en metode for stedsspesifikk fluorescerende merking av bakterielle utskillede effektorer, så vel som andre vanskelig å merke proteiner, ved bruk av genetisk kodeutvidelse (GCE). Dette papiret gir en komplett trinnvis protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av GCE-spesifikt, etterfulgt av instruksjoner for avbildning av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)

Nylige funn tyder på at inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via GCE, etterfulgt av bio-ortogonal merking med tetrazinholdige fargestoffer, er en levedyktig teknikk for selektiv merking og visualisering av bakterielle utskillede proteiner og påfølgende bildeanalyse i verten. Målet med denne artikkelen er å gi en enkel og klar protokoll som kan brukes av etterforskere som er interessert i å gjennomføre superoppløsningsavbildning ved hjelp av GCE for å studere ulike biologiske prosesser i bakterier og virus, samt vertspatogeninteraksjoner.

Introduction

Bakterielle infeksjoner har lenge vært ansett som en alvorlig fare for menneskers helse. Patogener bruker høyt utviklede, ekstremt kraftige og intrikate forsvarssystemer, samt en rekke bakterielle virulensfaktorer (referert til som effektorproteiner) for å unngå vertsimmunresponser og etablere infeksjoner ^1,2. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse systemene og rollen til individuelle effektorproteiner fortsatt stort sett ukjente på grunn av mangelen på egnede tilnærminger for direkte å følge de avgjørende proteinkomponentene og effektorene i vertsceller under patogenesen.

Et typisk eksempel er Salmonella enterica serovar Typhimurium, som forårsaker akutt gastroenteritt. Salmonella Typhimurium bruker type tre sekresjonssystemer (T3SS) for å injisere en rekke effektorproteiner direkte inn i vertsceller. Så snart Salmonella kommer inn i vertscellen, ligger den i et surt membranbundet rom, kalt Salmonella-inneholdende vakuol (SCV) ^3,4. Den sure pH i SCV aktiverer Salmonella patogenisitet øya 2 (SPI-2)-kodet T3SS og translokerer en volley av 20 eller flere effektorproteiner over vakuolar membranen inn i verten cytosol 5,6,7,8. Inne i verten manipulerer disse komplekse cocktailer av effektorproteiner koordinat vertscellesignalveier, noe som resulterer i dannelsen av svært dynamiske, komplekse rørformede membranstrukturer utvidet fra SCV langs mikrotubuli, kalt Salmonella-induserte filamenter (SIF), som gjør det mulig for Salmonella å overleve og replikere i vertscellene^9,10,11.

Metoder for å visualisere, spore og overvåke bakterielle effektorlokaliseringer, og undersøke deres handel og interaksjoner i vertsceller, gir kritisk innsikt i mekanismene som ligger til grunn for bakteriell patogenese. Merking og lokalisering av Salmonella-utskilte T3SS-effektorproteiner inne i vertsceller har vist seg å være en teknologisk utfordring^12,13; Ikke desto mindre har utviklingen av genetisk kodede fluorescerende proteiner forvandlet vår evne til å studere og visualisere proteiner i levende systemer. Imidlertid er størrelsen på fluorescerende proteiner (~ 25-30 kDa) 15 ofte sammenlignbar med eller enda større enn proteinet av interesse (POI; f.eks. ^13,65 kDa for SsaP, 37,4 kDa for SifA). Faktisk blokkerer fluorescerende proteinmerking av effektorer ofte sekresjonen av den merkede effektoren og syltetøy T3SS¹⁴.

Videre er fluorescerende proteiner mindre stabile og avgir et lavt antall fotoner før fotobleking, noe som begrenser bruken i superoppløsningsmikroskopiske teknikker^16,17,18^, spesielt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Mens de fotofysiske egenskapene til organiske fluorescerende fargestoffer er bedre enn fluorescerende proteiner, krever metoder/teknikker som CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 og HA-Tags ^24,25 et ekstra protein- eller peptidvedheng som kan svekke strukturfunksjonen til effektorproteinet av interesse ved å forstyrre posttranslasjonell modifikasjon eller handel. En alternativ metode som minimerer nødvendig proteinmodifisering innebærer inkorporering av ncAAs i et POI under oversettelse gjennom GCE. NCAene er enten fluorescerende eller kan gjøres fluorescerende via klikkkjemi 12,13,26,27,28.

Ved hjelp av GCE kan ncAAs med små, funksjonelle, bio-ortogonale grupper (som en azid-, cyklopropen- eller cyklooktynegruppe) introduseres på nesten hvilket som helst sted i et målprotein. I denne strategien byttes et innfødt kodon med et sjeldent kodon som et gult (TAG) stoppkodon i en spesifisert posisjon i genet til POI. Det modifiserte proteinet uttrykkes deretter i celler sammen med et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase / tRNA-par. Det aktive tRNA-syntetase-stedet er designet for å motta bare en bestemt ncAA, som deretter er kovalent festet til 3′-enden av tRNA som gjenkjenner det gule kodonet. ncAA blir ganske enkelt introdusert i vekstmediet, men det må tas opp av cellen og nå cytosolen der aminoacyl-tRNA-syntetasen (aaRS) kan koble den til det ortogonale tRNA; den blir deretter innlemmet i POI på det angitte stedet (se figur 1)¹². Dermed muliggjør GCE stedsspesifikk inkorporering av en mengde bio-ortogonale reaktive grupper som keton, azid, alkyn, cyklooktin, transsyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-umettet amid og bicyclo [6.1.0]-nonyne i en POI, potensielt overvinne begrensningene i konvensjonelle proteinmerkingsmetoder 12,26,27,28.

Nylige fremvoksende trender i superoppløsningsbildebehandlingsteknikker har åpnet nye veier for å undersøke biologiske strukturer på molekylært nivå. Spesielt har STORM, en enkeltmolekylær, lokaliseringsbasert, superoppløsningsteknikk, blitt et uvurderlig verktøy for å visualisere cellulære strukturer ned til ~ 20-30 nm og er i stand til å undersøke biologiske prosesser ett molekyl om gangen, og dermed oppdage rollene til intracellulære molekyler som ennå er ukjente i tradisjonelle ensemble-gjennomsnittlige studier¹³ . Enkeltmolekylære og superoppløsningsteknikker krever en liten tag med lyse, fotostabile organiske fluoroforer for best oppløsning. Vi har nylig demonstrert at GCE kan brukes til å inkorporere egnede sonder for superoppløsningsavbildning¹².

To av de beste valgene for proteinmerking i celler er bicyclo [6.1.0] nonynelysin (BCN) og trans-cyklookten-lysin (TCO; vist i figur 1), som kan være genetisk kodet ved hjelp av en variant av tRNA / syntetaseparet (her kalt tRNA Pyl/PylRS^AF), hvor^Pyl representerer pyrrolysin, og AF representerer en rasjonelt utformet dobbeltmutant (Y306A, Y384F) avledet fra Methanosarcina mazei som naturlig koder for pyrrolysin¹²^, 29,30,31. Gjennom den belastningsfremmende inverse Diels-Alder-sykloaddisjonsreaksjonen (SPIEDAC) reagerer disse aminosyrene kjemoselektivt med tetrazinkonjugater (figur 1)12,30,31. Slike sykloaddisjonsreaksjoner er eksepsjonelt raske og kompatible med levende celler; De kan også være fluorogene, hvis en passende fluorofor er funksjonalisert med tetrazindelen^12,26,32. Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll for overvåking av dynamikken til bakterielle effektorer levert inn i vertsceller ved hjelp av GCE, etterfulgt av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av dSTORM. Resultatene indikerer at inkorporering av en ncAA via GCE, etterfulgt av en klikkreaksjon med fluorogene tetrazinbærende fargestoffer, representerer en allsidig metode for selektiv merking, visualisering av utskilte proteiner og påfølgende subcellulær lokalisering i verten. Alle komponentene og prosedyrene som er beskrevet her, kan imidlertid justeres eller erstattes slik at GCE-systemet kan tilpasses for å undersøke andre biologiske spørsmål.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon Klon genet som uttrykker POI til et uttrykksplasmid (f.eks. pET28a-sseJ 10TAG) som uttrykker POI i E. coli BL21 (DE3). Dette trinnet letter å bestemme at mutantene er funksjonelle. For visualisering av Salmonella-utskilte effektorer i vertsceller, konstruer et ekspresjonsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) som uttrykker målet POI SseJ under kontroll av sin opprinnelige promotor, som beskrevet i tidligere rapporter</s…

Representative Results

Dette protokollpapiret beskriver en GCE-basert metode for stedsspesifikk fluorescerende merking og visualisering av Salmonella-utskilte effektorer, som vist i figur 1. Kjemisk struktur av ncAA-bærende transsyklookten bioortogonal gruppe (TCO) og fluorescerende fargestoff er vist i figur 1A. SseJ-merking ble oppnådd ved genetisk inkorporering av bioortogonale ncAAs ved et gult stoppkodon (se figur 1…

Discussion

Tilnærmingen beskrevet her ble brukt til å spore den nøyaktige plasseringen av effektorproteiner injisert i vertscellen av bakterien T3SS etter infeksjon. T3SS er ansatt av intracellulære patogener som Salmonella, Shigella og Yersinia for å transportere virulenskomponenter inn i verten. Utviklingen av superoppløsningsteknologier har gjort det mulig å visualisere virulensfaktorer ved en tidligere utenkelig oppløsning^12,13,24^…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra University of Texas Medical branch, Galveston, TX, og en Texas STAR-pris til LJK Vi takker professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) for plasmid pEVOL-PylRS-AF. Bildene i figur 1 ble laget ved hjelp av BioRender.

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

Riferimenti

Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).