Här presenteras ett protokoll för att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera höger- och vänsterkammarfunktionen hos donatorhjärtan efter kallkonservering med hjälp av ett ex vivo-perfusionssystem .
Primär transplantatdysfunktion (PGD) är fortfarande den främsta orsaken till tidig död efter hjärttransplantation. Förlängd ischemisk tid under köldkonservering är en viktig riskfaktor för PGD, och tillförlitlig utvärdering av hjärtfunktionen är avgörande för att studera donatorhjärtats funktionella respons efter köldkonservering. Den medföljande videon beskriver en teknik för att bedöma murina höger- och vänsterkammarfunktioner med hjälp av ex vivo-perfusion baserad på en Langendorff-modell efter kylkonservering under olika varaktigheter. I korthet isoleras hjärtat och förvaras i en kall histidin-tryptofan-ketoglutaratlösning (HTK). Därefter perfunderas hjärtat med en Kreb-buffert i en Langendorff-modell i 60 minuter. En silikonballong förs in i vänster och höger kammare, och hjärtats funktionella parametrar registreras (dP/dt, tryck-volym-relationer). Detta protokoll möjliggör tillförlitlig utvärdering av hjärtfunktionen efter olika hjärtbevarande protokoll. Viktigt är att denna teknik gör det möjligt att studera hjärtbevarande svar specifikt i naturliga hjärtceller. Användningen av mycket små murina hjärtan ger tillgång till en enorm mängd transgena möss för att undersöka mekanismerna för PGD.
Hjärttransplantation förbättrar överlevnaden och livskvaliteten hos patienter med hjärtsvikt i slutstadiet1. Dessvärre begränsar bristen på hjärtdonatorer antalet patienter som kan dra nytta av denna behandling och begränsar klinikernas förmåga att optimalt matcha donatorer med mottagare 2,3,4. Dessutom har det nya tilldelningssystemet bidragit till längre ischemiska tider och avsevärt ökat användningen av marginella donatorer sedan 20185. Följaktligen ökar medelåldern för hjärtdonatorer och den ischemiska tiden med tiden, vilket leder till en högre frekvens av primär transplantatdysfunktion (PGD) trots signifikanta förbättringar i strategierna för hjärtbevarande 6.
PGD kan drabba vänster, höger eller båda kamrarna och är fortfarande en livshotande komplikation som utgör den främsta orsaken till tidig död efter hjärttransplantation. Att undersöka mekanismerna för PDG och utveckling av strategier för bättre hjärtbevarande är viktiga överväganden, med tanke på den potentiella livräddande effekten på hjärtmottagare. Därför är experimentella modeller som möjliggör en robust och tillförlitlig bedömning av donatorers hjärtfunktion efter en längre lagringstid avgörande för att öka vår förståelse för PGD och underlätta utvecklingen av nya terapier. Förmågan att noggrant bedöma hjärtfunktionen i mushjärtat ger tillgång till en stor repertoar av transgena murina modeller som exakt kan identifiera PGD-mekanismer.
I fysiologiska och farmakologiska studier används Langendorffs retrograda perfusionsmodell i stor utsträckning för att bedöma hjärtfunktion7. Specifikt detekteras hjärtprestanda av en silikonballong ansluten till en tryckgivare i vänster kammare (LV). En viktig egenskap hos PGD är den otillräckliga sammandragningen och avslappningen av ventrikelmuskeln. Tidigare Langendorff-studier har fokuserat på att använda en LV-ballong för att producera tillförlitliga och reproducerbara resultat vid LV-funktionsbedömning 8,9,10. Användningen av en intrakavitär ballong för att bedöma högerkammarfunktionen (RV) med hjälp av ballongsystemet är dock mindre välkänd.
Med tanke på en signifikant PGD-frekvens som involverar RV efter transplantation11, skulle experimentella metoder för att studera både LV och RV-funktion hjälpa till att bestämma de molekylära och fysiologiska mekanismerna som bidrar till RV PGD. Detta protokoll visar att intrakavitära silikonballonger kan ge tillförlitliga bedömningar av LV- och RV-funktion i samma murina hjärta12. För att utvärdera den potentiella användningen av Langendorff-systemet i PGD-studien undersökte vi hjärtfunktionerna med olika lagringsperioder och fann minskad hjärtfunktion vid sammandragning och avslappning med långvarig kylförvaring av murina hjärtan. Intressant nog har LV en högre funktionsreduktion än RV. Sammanfattningsvis kan det protokoll som beskrivs här användas för att bedöma effekten av en läkemedelskandidat och molekylära vägar på både LV- och RV-funktion. Möjligheten att använda denna metod på murina hjärtan kommer att underlätta utförandet av detaljerade mekanistiska studier.
Detta protokoll beskriver den retrograda perfusionsmetoden Langendorff via aortakanylering. Denna teknik kan användas för att utvärdera LV- och RV-funktionen hos murina hjärtan efter kylförvaring. Resultaten visar att långvarig kylförvaring av donatorhjärtan leder till nedsatt hjärtfunktion i både LV och RV med hjälp av detta protokoll.
Studierna av akut och kronisk avstötning efter hjärttransplantation fokuserar i stor utsträckning på immunobiologi14. Effekterna av naturliga celler på PGD under kylförvaring är mindre väl undersökta. PGD förekommer i ~10%-20% av hjärttransplantationerna och står för 66% av de tidiga dödsfallen inom 30 dagar efter transplantationen. I synnerhet skiljer sig incidensen av PGD som påverkar LV jämfört med RVefter transplantation 11. Utan bidrag från mottagarens cellulära svar fokuserar denna ex vivo-metod på bidragen från naturliga hjärtceller till PGD efter kall konservering av donatorhjärtan. Ytterligare studier kan inkludera mottagarsvar i en murin hjärttransplantationsmodell.
I detta protokoll fokuserade Langendorff-perfusionen av kallkonserverade donatorhjärtan på de naturliga hjärtsvaren på varm kristalloid perfusion utan att infiltrera cellulär immunitet. För att uppnå reproducerbara resultat standardiserades flera kritiska steg. Mushjärtana stoppades med HTK-lösning och förvarades i iskall HTK, på samma sätt som klinisk praxis. Perfusionsvolymen och infusionstiden för HTK-lösningen för varje hjärta övervakades noggrant med en timer. Donatorhjärtat förvarades i förkylda rör på is innehållande HTK i ett rum med 4 °C. Kanyleringstiden standardiserades till ~3 min före perfusion. Alla dessa steg säkerställde att köldkonserveringstiden var den viktigaste variabeln i studien.
En period av oregelbunden hjärtkontraktilitet i ~20 minuter sågs ofta i början av perfusionen. Denna jämvikts- och återhämtningsperiod underlättades av gradvis uppvärmning och syresättning av hjärtvävnaden. En relativt stabil period förväntades efter de inledande 20 minuterna. Ballongen fördes in i ventrikelhålan vid ~18 minuter efter den initiala jämviktsperioden. Vi började registrera hemodynamik efter att hjärtat varit stabilt i ~25 minuter, när ballongen sattes in. Perfusion med KH-buffert bibehöll stabil hjärtfunktion i ~1,5-2 timmar. Vi valde därför att registrera hemodynamiken i 20 minuter i var och en av vänster och höger kammare.
Det finns flera begränsningar för retrograd perfusion för att studera PGD i hjärtan efter kylförvaring. För det första, på grund av ballongstorleken och bristen på utrymme i varje kammare (i synnerhet RV), är det mycket utmanande att samtidigt sätta in två ballonger i både LV och RV. Således mäter vi funktionen av RV och LV sekventiellt. Det är viktigt att notera att den interventrikulära skiljeväggen bidrar avsevärt till både vänster och höger kammarfunktion. Septum bidrar till ~50% av höger kammarfunktion, så det finns ett interventrikulärt beroende15. Det är också viktigt att notera att medan procedurerna för reperfusion av murinhjärtat i Langendorff-enheten tar ~3 min, tar kirurgisk implantation av det mänskliga hjärtat i det relativt varma kirurgiska fältet ~45 min. I jämförelse ådrar sig det murina hjärtat i detta Langendorff-system mindre ischemisk tid. Detta bör beaktas när klinisk översättning övervägs.
Eftersom vi använde KH-buffert för att perfusionera hjärtat utan blod, kan detta också ha mindre effektivitet i syretillförseln. Hjärtfunktionen är dock relativt stabil under de första 1,5-2 timmarna av perfusion, vilket möjliggör tillförlitliga hemodynamiska mätningar. Tyvärr finns det för närvarande inga fungerande hjärtperfusionsmodeller för dessa mindre murina hjärtan, och effekten av kammarbelastning kan inte utvärderas i detta system. Trots detta är perfusionssystemet mycket reproducerbart och mindre arbetsintensivt och tidskrävande än transplantationsmodeller. Det är också billigare än transplantationsstudier, vilket kan göra det mer lämpligt för screening av olika terapeutiska alternativ och olika molekylära vägar. Med modifieringar av konserveringslösningar genom att lägga till läkemedelskandidater kan denna plattform användas för att utvärdera effekterna av farmakologiska medel för att minska PGD i både LV och RV.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |