يظهر هنا بروتوكول لتحديد وظيفة البطين الأيمن والأيسر لقلوب المتبرعين بشكل موثوق بعد الحفاظ على البرد باستخدام نظام التروية خارج الجسم الحي .
لا يزال خلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) هو السبب الرئيسي للوفاة المبكرة بعد زرع القلب. يعد الوقت الإقفاري المطول أثناء الحفظ البارد عامل خطر مهم ل PGD ، والتقييم الموثوق لوظيفة القلب ضروري لدراسة الاستجابات الوظيفية لقلب المتبرع بعد الحفاظ على البرد. يصف الفيديو المصاحب تقنية لتقييم وظيفة البطين الأيمن والأيسر للفأر باستخدام التروية خارج الجسم الحي القائمة على نموذج Langendorff بعد الحفاظ على البرد لفترات مختلفة. باختصار ، يتم عزل القلب وتخزينه في محلول هيستيدين – تريبتوفان – كيتوغلوتارات بارد (HTK). بعد ذلك ، يتم تخلل القلب بمخزن كريب المؤقت في نموذج Langendorff لمدة 60 دقيقة. يتم إدخال بالون سيليكون في البطين الأيسر والأيمن ، ويتم تسجيل المعلمات الوظيفية للقلب (dP / dt ، علاقات الضغط والحجم). يسمح هذا البروتوكول بالتقييم الموثوق لوظيفة القلب بعد بروتوكولات الحفاظ على القلب المختلفة. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية بدراسة استجابات الحفاظ على القلب على وجه التحديد في خلايا القلب الأصلية. يسمح استخدام قلوب الفئران الصغيرة جدا بالوصول إلى مجموعة هائلة من الفئران المعدلة وراثيا للتحقيق في آليات التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD).
زرع القلب يحسن البقاء على قيد الحياة ونوعية الحياة في المرضى الذين يعانون من قصور القلب في نهاية المرحلة1. لسوء الحظ ، فإن النقص في المتبرعين بالقلب يحد من عدد المرضى الذين يمكنهم الاستفادة من هذا العلاج ويحد من قدرة الأطباء على مطابقة المتبرعين على النحو الأمثل مع المتلقين2،3،4. علاوة على ذلك ، ساهم نظام التخصيص الجديد في إطالة أوقات نقص تروية الدم وزيادة استخدام المانحين الهامشيين بشكل كبير منذ عام 20185. وبالتالي ، فإن متوسط عمر المتبرعين بالقلب والوقت الإقفاري يتزايد بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل خلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) على الرغم من التحسينات الكبيرة في استراتيجيات الحفاظ على القلب 6.
يمكن أن يؤثر التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) على البطينين الأيسر أو الأيمن أو كليهما، ويظل من المضاعفات المهددة للحياة ويمثل السبب الرئيسي للوفيات المبكرة بعد زراعة القلب. يعد التحقيق في آليات PDG وتطوير استراتيجيات للحفاظ على القلب بشكل أفضل من الاعتبارات المهمة ، نظرا للتأثير المحتمل لإنقاذ الحياة على متلقي القلب. لذلك، فإن النماذج التجريبية التي تسمح بإجراء تقييم قوي وموثوق لوظيفة قلب المتبرع بعد وقت تخزين طويل ضرورية لزيادة فهمنا للتشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) وتسهيل تطوير علاجات جديدة. تتيح القدرة على تقييم وظيفة القلب بدقة في قلب الفأر الوصول إلى ذخيرة واسعة من نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي يمكنها تحديد آليات التشخيص الوراثي قبل الزرع بدقة.
في الدراسات الفسيولوجية والدوائية ، يستخدم نموذج التروية الرجعية Langendorff على نطاق واسع لتقييم وظائف القلب7. على وجه التحديد ، يتم الكشف عن أداء القلب بواسطة بالون سيليكون متصل بمحول ضغط داخل تجويف البطين الأيسر (LV). من السمات الرئيسية للتشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) عدم كفاية انقباض العضلات البطينية وانبساطها. ركزت دراسات Langendorff السابقة على استخدام بالون الجهد المنخفض لإنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في التقييم الوظيفيللجهد المنخفض 8،9،10. ومع ذلك ، فإن استخدام البالون داخل الأجواف لتقييم وظيفة البطين الأيمن (RV) باستخدام نظام البالون أقل إدراكا.
بالنظر إلى معدل PGD الكبير الذي يتضمن RV بعد الزرع11 ، فإن الطرق التجريبية لدراسة كل من وظيفة LV و RV ستساعد في تحديد الآليات الجزيئية والفسيولوجية التي تساهم في RV PGD. يوضح هذا البروتوكول أن بالونات السيليكون داخل الأجواف يمكن أن توفر تقييمات موثوقة لوظيفة LV و RV في نفس قلب الفئران12. لتقييم الاستخدام المحتمل لنظام Langendorff في دراسة التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD)، فحصنا وظائف القلب مع فترات تخزين مختلفة ووجدنا انخفاضا في وظائف القلب في الانقباض والاسترخاء مع التخزين البارد لفترات طويلة لقلوب الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أن LV لديه انخفاض وظيفي أعلى من عربة سكن متنقلة. باختصار ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتقييم تأثير الدواء المرشح والمسارات الجزيئية على كل من وظيفة LV و RV. القدرة على استخدام هذه الطريقة على قلوب الفئران ستسهل أداء الدراسات الميكانيكية التفصيلية.
يصف هذا البروتوكول طريقة التروية الرجعية Langendorff عن طريق قنية الأبهر. يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم وظيفة LV و RV لقلوب الفئران بعد التخزين البارد. تظهر النتائج أن التخزين البارد لفترات طويلة لقلوب المتبرعين يؤدي إلى انخفاض وظائف القلب في كل من LV و RV باستخدام هذا البروتوكول.
تركز دراسات الرفض الحاد والمزمن بعد زراعة القلب على نطاق واسع على علم المناعة14. يتم فحص آثار الخلايا الأصلية على التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) أثناء التخزين البارد بشكل أقل دقة. يحدث التشخيص الوراثي قبل الزرع في ~ 10٪ -20٪ من عمليات زرع القلب ويمثل 66٪ من الوفاة المبكرة في غضون 30 يوما بعد الزرع. على وجه الخصوص ، يختلف حدوث PGD الذي يؤثر على LV مقابل RV بعد الزرع11. بدون مساهمة الاستجابات الخلوية المتلقية ، تركز هذه الطريقة خارج الجسم الحي على مساهمات خلايا القلب الأصلية في التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) بعد الحفاظ البارد على قلوب المتبرعين. قد تتضمن الدراسات الإضافية استجابات المتلقي في نموذج زراعة قلب الفئران.
في هذا البروتوكول ، ركز نضح لانجيندورف لقلوب المتبرعين المحفوظة على البارد على الاستجابات القلبية الأصلية للنضح البلوري الدافئ دون التسلل إلى المناعة الخلوية. لتحقيق نتائج قابلة للتكرار ، تم توحيد العديد من الخطوات الحاسمة. تم القبض على قلوب الفئران باستخدام محلول HTK وتخزينها في HTK المثلج ، على غرار الممارسة السريرية. تمت مراقبة حجم التروية ووقت التسريب لمحلول HTK لكل قلب عن كثب باستخدام جهاز توقيت. تم الاحتفاظ بقلب المتبرع في أنابيب مبردة مسبقا على ثلج يحتوي على HTK في غرفة 4 درجات مئوية. وقت القنية waas موحدة إلى ~ 3 دقائق قبل التروية. كل هذه الخطوات ضمنت أن مدة الحفظ البارد كانت المتغير الرئيسي في الدراسة.
شوهدت فترة من انقباض القلب غير المنتظم لمدة ~ 20 دقيقة بشكل شائع في بداية التروية. تم تسهيل فترة التوازن والتعافي هذه عن طريق الاحترار التدريجي وأكسجة أنسجة القلب. كان من المتوقع فترة مستقرة نسبيا بعد 20 دقيقة الأولية. تم إدخال البالون في تجويف البطين في ~ 18 دقيقة بعد فترة التوازن الأولية. بدأنا في تسجيل ديناميكا الدم بعد أن كان القلب مستقرا لمدة ~ 25 دقيقة ، بمجرد إدخال البالون. حافظ التروية مع المخزن المؤقت KH على أداء قلبي مستقر لمدة ~ 1.5-2 ساعة. لذلك اخترنا تسجيل ديناميكا الدم لمدة 20 دقيقة في كل من البطينين الأيسر والأيمن.
هناك العديد من القيود على التروية الرجعية لدراسة التشخيص الوراثي قبل الزرع للقلوب بعد التخزين البارد. أولا ، نظرا لحجم البالون ونقص المساحة في كل تجويف بطيني (على وجه الخصوص ، RV) ، فإن الإدخال المتزامن لبالونين في كل من LV و RV يمثل تحديا كبيرا. وبالتالي ، فإننا نقيس وظيفة RV و LV بالتتابع. من المهم أن نلاحظ أن الحاجز بين البطينين يساهم بشكل كبير في وظيفة البطين الأيسر والأيمن. يساهم الحاجز في ~ 50٪ من وظيفة البطين الأيمن ، لذلك هناك اعتماد بين البطينين15. من المهم أيضا ملاحظة أنه في حين أن إجراءات إعادة ضخ قلب الفئران في جهاز Langendorff تستغرق ~ 3 دقائق ، فإن الزرع الجراحي لقلب الإنسان في المجال الجراحي الدافئ نسبيا يستغرق ~ 45 دقيقة. وبالمقارنة ، فإن قلب الفئران في نظام Langendorff هذا يتحمل وقتا أقل لنقص تروية. يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند التفكير في الترجمة السريرية.
نظرا لأننا استخدمنا المخزن المؤقت KH لتغذية القلب بدون دم ، فقد يكون لهذا أيضا كفاءة أقل في توصيل الأكسجين. ومع ذلك ، فإن وظيفة القلب مستقرة نسبيا من خلال 1.5-2 ساعة من التروية الأولية ، مما يسمح بقياسات الدورة الدموية الموثوقة. لسوء الحظ ، لا توجد حاليا نماذج قابلة للتطبيق لنضح القلب العامل لقلوب الفئران الأصغر هذه ، ولا يمكن تقييم تأثير تحميل البطين في هذا النظام. على الرغم من ذلك ، فإن نظام التروية قابل للتكرار بدرجة كبيرة وأقل كثافة في العمل ويستغرق وقتا طويلا من نماذج الزرع. كما أنها أقل تكلفة من دراسات الزرع ، مما قد يجعلها أكثر ملاءمة لفحص الخيارات العلاجية المختلفة والمسارات الجزيئية المختلفة. مع التعديلات على حلول الحفظ عن طريق إضافة الأدوية المرشحة ، يمكن استخدام هذه المنصة لتقييم آثار العوامل الدوائية على تقليل التشخيص الوراثي قبل الزرع في كل من LV و RV.
The authors have nothing to disclose.
اي.
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |