عزل ناقلات العلاج الجيني من الجيل التالي من خلال الهندسة والترميز الشريطي وفحص متغيرات قفيصة الفيروس المرتبط بالغدي (AAV)
Summary
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV والتحقق اللاحق من خلال الترميز الشريطي للمرشحين ذوي الخصائص الجديدة لإنشاء الجيل التالي من AAVs.
Abstract
تعد نواقل توصيل الجينات المشتقة من الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) واحدة من أكثر الأدوات الواعدة لعلاج الأمراض الوراثية ، ويتضح ذلك من خلال تشجيع البيانات السريرية والموافقة على العديد من العلاجات الجينية AAV. هناك سببان رئيسيان لنجاح نواقل AAV هما (i) العزل المسبق لمختلف الأنماط المصلية الفيروسية التي تحدث بشكل طبيعي مع خصائص مميزة ، و (ii) الإنشاء اللاحق لتقنيات قوية لهندستها الجزيئية وإعادة توظيفها في إنتاجية عالية. ومما يعزز إمكانات هذه التقنيات مؤخرا استراتيجيات تم تنفيذها لترميز قفيصات AAV مختارة على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، مما يسمح بتقسيمها الطبقي الشامل والمتوازي في الجسم الحي في جميع الأعضاء الرئيسية وأنواع الخلايا في واحد. هنا ، نقدم خط أنابيب أساسي يشمل هذه المجموعة من السبل التكميلية ، باستخدام عرض الببتيد AAV لتمثيل الترسانة المتنوعة لتقنيات هندسة القفيصة المتاحة. وفقا لذلك ، نصف أولا الخطوات المحورية لإنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV للاختيار في الجسم الحي للمرشحين ذوي الخصائص المطلوبة ، متبوعا بعرض توضيحي لكيفية ترميز متغيرات القفيصة الأكثر إثارة للاهتمام للفحص الثانوي في الجسم الحي . بعد ذلك ، نمثل منهجية إنشاء مكتبات لتسلسل الجيل التالي (NGS) ، بما في ذلك تضخيم الباركود وربط المحول ، قبل أن نختتم بنظرة عامة على الخطوات الأكثر أهمية أثناء تحليل بيانات NGS. نظرا لأن البروتوكولات المذكورة هنا متعددة الاستخدامات وقابلة للتكيف ، يمكن للباحثين تسخيرها بسهولة لإثراء متغيرات قفيصة AAV المثلى في نموذج المرض المفضل لديهم ولتطبيقات العلاج الجيني.
Introduction
العلاج بنقل الجينات هو إدخال مادة وراثية في الخلايا لإصلاح المادة الوراثية الخلوية أو استبدالها أو تغييرها للوقاية من المرض أو علاجه أو علاجه أو تحسينه. يعتمد نقل الجينات ، سواء في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي ، على أنظمة توصيل مختلفة ، غير فيروسية وفيروسية. تطورت الفيروسات بشكل طبيعي لتحويل خلاياها المستهدفة بكفاءة ويمكن استخدامها كناقلات توصيل. من بين الأنواع المختلفة من النواقل الفيروسية المستخدمة في العلاج الجيني ، تم استخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي بشكل متزايد ، نظرا لافتقارها إلى الإمراضية والسلامة وانخفاض المناعة ، والأهم من ذلك قدرتها على الحفاظ على التعبير طويل الأجل وغير المتكامل1،2،3. حقق العلاج الجيني AAV إنجازات كبيرة على مدى العقد الماضي. تمت الموافقة على ثلاثة علاجات من قبل وكالة الأدوية الأوروبية وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية للاستخدام في البشر 3,4. كما تجري العديد من التجارب السريرية لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض ، مثل الهيموفيليا وأمراض العضلات والقلب والأمراض العصبية ، كما تمت مراجعته في مكان آخر3. على الرغم من عقود من التقدم ، شهد مجال العلاج الجيني سلسلة من النكسات في السنوات الأخيرة4 ، وأهمها الوفيات في التجارب السريرية5 التي تم تعليقها بسبب السمية التي تحد من الجرعة ، خاصة بالنسبة للأنسجة الضخمة ، مثل العضلات ، أو التي يصعب الوصول إليها ، مثل الدماغ6.
تنتمي ناقلات AAV المستخدمة حاليا في التجارب السريرية إلى الأنماط المصلية الطبيعية مع استثناءات قليلة1. توفر هندسة AAV الفرصة لتطوير ناقلات ذات خصوصية وكفاءة فائقة للأعضاء أو الخلايا. في العقدين الماضيين ، تم تطبيق العديد من الأساليب بنجاح ، مثل عرض الببتيد ، ومبادلة الحلقة ، وخلط الحمض النووي للقفيصة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ ، والتصميم المستهدف ، لإنشاء متغيرات AAV فردية أو مكتبات لها بخصائص متنوعة7. ثم تخضع هذه لجولات متعددة من التطور الموجه لتحديد المتغيرات داخلها مع الخصائص المطلوبة ، كما تمت مراجعته في مكان آخر 1,3. من بين جميع استراتيجيات تطور القفيصة ، كانت مكتبات عرض الببتيد AAV هي الأكثر استخداما ، نظرا لبعض الخصائص الفريدة: فهي سهلة التوليد نسبيا ، ويمكنها تحقيق تنوع عال وتسلسل عالي الإنتاجية ، مما يسمح بتتبع تطورها.
تم وصف أول مكتبات AAV ناجحة لإدخال الببتيد منذ ما يقرب من 20 عاما. في واحدة من الأولى ، قام Perabo et al.8 ببناء مكتبة من قفيصات AAV2 المعدلة ، حيث تم إدخال مجموعة من قليل النوكليوتيدات المولدة عشوائيا في بلازميد في موضع يتوافق مع الأحماض الأمينية 587 من بروتين قفيصة VP1 ، في المحور ثلاثي الأضواط البارز من القفيصة. باستخدام العدوى المشتركة للفيروس الغدي ، تم تطوير مكتبة AAV من خلال جولات متعددة من الاختيار ، وتبين أن المتغيرات النهائية المعاد استهدافها قادرة على تحويل خطوط الخلايا المقاومة إلى AAV28 الأبوي. بعد ذلك بوقت قصير ، قدم Müller et al.9 نظام الخطوتين لإنتاج المكتبات ، وهو تحسن كبير في البروتوكول. في البداية ، يتم استخدام مكتبة البلازميد ، جنبا إلى جنب مع البلازميد المساعد للفيروسات الغدية ، لإنتاج مكتبة AAV تحتوي على قفيصات خيمرية. تستخدم مكتبة مكوك AAV هذه لإصابة الخلايا بمضاعفات منخفضة للعدوى (MOI) ، بهدف إدخال جينوم فيروسي واحد لكل خلية. تضمن العدوى المشتركة بالفيروس الغدي إنتاج AAVs مع جينوم مطابق وقفيصة9. بعد حوالي عقد من الزمان ، استخدم Dalkara10 التطور الموجه في الجسم الحي لإنشاء متغير 7m8. يحتوي هذا المتغير على 10 إدخال حمض أميني (LALGETTRPA) ، ثلاثة منها تعمل كروابط ، وتستهدف الشبكية الخارجية بكفاءة بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي10. هذه القفيصة الهندسية هي قصة نجاح استثنائية ، لأنها واحدة من القفيصات الهندسية القليلة التي وصلت إلى العيادة حتى الآن11.
شهد المجال دفعة ثانية مع إدخال تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS). عرض منشوران من Adachi et al.12 في عام 2014 ومن Marsic et al.13 في عام 2015 ، قوة NGS لتتبع توزيع مكتبات قفيصة AAV المشفرة بدقة عالية. بعد بضع سنوات ، تم تكييف NGS لمناطق الباركود مع منطقة إدخال الببتيد لمتابعة تطور القفيصة. أجرى Körbelin et al.14 فحصا موجها ب NGS لتحديد قفيصة تعتمد على AAV2 تستهدف الرئة. ساعد تحليل NGS في حساب ثلاث درجات تصنيف: درجة الإثراء بين جولات الاختيار ، ودرجة الخصوصية العامة لتحديد خصوصية الأنسجة ، وأخيرا النتيجة المجمعة14. نشر مختبر Gradinaru15 نظام التطور المستهدف AAV القائم على Cre-reالتركيب (CREATE) في نفس العام ، مما يسهل الاختيار الخاص بنوع الخلية. في هذا النظام ، تحمل مكتبة capsid مفتاحا قابلا للعكس Cre ، حيث أن إشارة polyA محاطة بموقعين loxP. ثم يتم حقن مكتبة AAV في فئران Cre ، حيث يتم عكس إشارة polyA فقط في خلايا Cre + ، مما يوفر نموذجا لربط التمهيدي PCR العكسي مع التمهيدي الأمامي داخل جين القفيصة. مكن هذا الإنقاذ PCR المحدد للغاية من تحديد AAV-PHP. البديل B الذي يمكن أن يعبر حاجز الدم في الدماغ15. تم تطوير هذا النظام بشكل أكبر إلى M-CREATE (Multiplexed-CREATE) ، حيث تم دمج NGS وتوليد المكتبة الاصطناعية في خط الأنابيب16.
تسمح نسخة محسنة من هذا النظام القائم على الحمض النووي الريبي من مختبر ماجواير17 ، iTransduce ، بالاختيار على مستوى الحمض النووي للقفيصة التي تحول الخلايا وظيفيا وتعبر عن جينومها. يشتمل الجينوم الفيروسي لمكتبة عرض الببتيد على جين Cre تحت سيطرة مروج في كل مكان وجين قفيصة تحت سيطرة مروج p41. يتم حقن المكتبة في الفئران التي تحتوي على كاسيت loxP-STOP-loxP في المنبع من tdTomato. يمكن فرز الخلايا التي تم تحويلها باستخدام متغيرات AAV التي تعبر عن الجينوم الفيروسي وبالتالي Cre express tdTomato ، وبالاقتران مع علامات الخلايا ، واختيارها17. وبالمثل ، وضع Nonnenmacher et al.18 و Tabebordbar et al.19 مكتبة جينات القفيصة تحت سيطرة المروجين الخاصين بالأنسجة. بعد الحقن في نماذج حيوانية مختلفة ، تم استخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي لعزل متغيرات القفيصة.
هناك طريقة بديلة تتمثل في استخدام الترميز الشريطي لوضع علامة على مكتبات capsid. استخدم مختبر Björklund20 هذا النهج لمكتبات قفيصة إدخال الببتيد الباركود وطور تطور متجه AAV العقلاني المشفر بالباركود (BRAVE). في بلازميد واحد ، يتم استنساخ كاسيت Rep2Cap بجوار التكرارات الطرفية المقلوبة (ITR) ، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) – الذي يعبر عن الجينات المحورة ذات العلامات الشريطية . باستخدام مواقع loxP بين نهاية الغطاء وبداية الرمز الشريطي ، تولد إعادة التركيب Cre في المختبر جزءا صغيرا بما يكفي ل NGS ، مما يسمح بربط إدخال الببتيد بالرمز الشريطي الفريد (جدول البحث ، LUT). يتم تنفيذ إنتاج AAV باستخدام مكتبة البلازميد ويتم فحص الرموز الشريطية المعبر عنها في mRNA بعد تطبيق الجسم الحي ، مرة أخرى باستخدام NGS20. عندما تشتمل مكتبات القفيصة على متغيرات من جين القفيصة بالكامل (أي المكتبات المختلطة) ، يجب استخدام تسلسل القراءة الطويلة. استخدمت العديد من المجموعات الرموز الشريطية لوضع علامة على هذه المكتبات المتنوعة ، مما يتيح NGS بعمق قراءة أعلى. قام Kay lab21 بوضع علامة على مكتبات مختلطة شديدة التنوع مع الرموز الشريطية في اتجاه مجرى إشارة cap polyA. في الخطوة الأولى ، تم إنشاء مكتبة بلازميد مشفرة بالباركود ، وتم استنساخ مكتبة جينات القفيصة المختلطة فيها. ثم تم استخدام مزيج من MiSeq (قراءة قصيرة ، عمق قراءة أعلى) و PacBio (قراءة طويلة ، عمق قراءة أقل) NGS بالإضافة إلى تسلسل Sanger لإنشاء LUT21. في عام 2019 ، حدد Ogden وزملاؤه من مختبر Churchlab 22 ملاءمة قفيصة AAV2 لوظائف متعددة باستخدام المكتبات التي تحتوي على طفرات أحادية النقطة وعمليات إدراج وحذف في كل موضع ، مما مكن في النهاية من التصميم الموجه آليا. لتوليد المكتبة ، تم تصنيع أجزاء أصغر من جين القفيصة ، ووضع علامة عليها برمز شريطي ، وتسلسل الجيل التالي ، ثم استنساخها في جين القفيصة الكامل. تم استخدام بيانات NGS لإنشاء جدول بحث. ثم تم فحص المكتبة باستخدام الرموز الشريطية فقط وتسلسل القراءة القصيرة ، والذي بدوره يسمح بعمق قراءة أعلى22.
تم استخدام المكتبات المشفرة في الغالب لفحص مجموعة من المتغيرات المعروفة والطبيعية والهندسية بعد عدة جولات من اختيار مكتبات القفيصة أو مستقلة عن دراسة تطور القفيصة. ميزة هذه المكتبات هي فرصة فحص قفيصات متعددة ، مع تقليل أعداد الحيوانات وتقليل التباين بين الحيوانات. تم نشر الدراسات الأولى التي أدخلت هذه التكنولوجيا إلى مجال AAV منذ ما يقرب من عقد من الزمان. قام مختبر ناكاي 12 بوضع علامة على 191 طفرا مزدوجا من الألانين تغطي الأحماض الأمينية من 356 إلى 736 على VP1 من AAV9 مع زوج من الرموز الشريطية المكونة من12 نيوكليوتيد. باستخدام NGS ، تم فحص المكتبة في الجسم الحي لربط الجالاكتوز وخصائص أخرى12. حدد مارسيك وزملاؤه التوزيع الحيوي لمتغيرات AAV باستخدام تحليل مزدوج الشريط 1 بعد عام13. قارنت دراسة حديثة أجريت على الرئيسيات غير البشرية التوزيع الحيوي في الجهاز العصبي المركزي ل 29 قفيصة باستخدام طرق مختلفة للتوصيل23. نشر مختبرنا مؤخرا شاشات مكتبة AAV ذات الرموز الشريطية ل 183 متغيرا تضمنت AAVs طبيعية وهندسية. أدت هذه الشاشات على مستوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى تحديد متغير AAV عالي الانتحاءالعضلي 24 في الفئران بالإضافة إلى الآخرين الذين يعرضون خصوصية عالية من نوع الخلية في دماغالفأر 25.
هنا ، نصف المنهجية المستخدمة في هذا العمل ونتوسع فيها لتشمل فحص مكتبات عرض الببتيد AAV. ويشمل ذلك إنشاء مكتبات عرض الببتيد AAV2 ، وطريقة PCR الرقمية للقطرات (dd-PCR) للقياس الكمي ، وأخيرا خط أنابيب NGS لتحليل متغيرات AAV ، استنادا جزئيا إلى عمل Weinmann وزملائه24. أخيرا ، يتم تقديم وصف لإنشاء مكتبات AAV المشفرة بالباركود وخط أنابيب NGS المستخدم في نفس المنشور.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الخطوات اللازمة لعرض الببتيد هندسة قفيصة AAV ولفحص مكتبة AAV المشفرة بالباركود ، وكذلك للتحليل المعلوماتي الحيوي لتكوين المكتبة وأداء القفيصة. يركز هذا البروتوكول على الخطوات التي تسهل التحليل المعلوماتي الحيوي لهذه الأنواع من المكتبات ، لأن معظم مختبرات علم ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تقدر D.G. تقديرا كبيرا الدعم المقدم من مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) من خلال مراكز البحوث التعاونية DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) و TRR179 (Projektnummer 272983813) ، وكذلك من قبل المركز الألماني لأبحاث العدوى (DZIF، BMBF; TTU-فيروس نقص المناعة البشرية 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
Riferimenti
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
- Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
- Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
- Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
- Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
- Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
- Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
- Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
- Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
- Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
- Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
- Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
- Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
- Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
- Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
- Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
- Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
- Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
- Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
- Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
- Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
- Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
- Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
- Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
- Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
- Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
- Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
- Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
- Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
- Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).
