Выделение векторов генной терапии следующего поколения с помощью инженерии, штрих-кодирования и скрининга вариантов капсида аденоассоциированного вируса (AAV)
Summary
Генерация библиотеки пептидных дисплеев AAV и последующая проверка с помощью штрих-кодирования кандидатов с новыми свойствами для создания AAV следующего поколения.
Abstract
Векторы доставки генов, полученные из аденоассоциированного вируса (AAV), являются одним из наиболее перспективных инструментов для лечения генетических заболеваний, о чем свидетельствуют обнадеживающие клинические данные и одобрение нескольких генных терапий AAV. Двумя основными причинами успеха векторов AAV являются (i) предварительное выделение различных встречающихся в природе вирусных серотипов с различными свойствами и (ii) последующее создание мощных технологий для их молекулярной инженерии и перепрофилирования с высокой пропускной способностью. Дальнейшим повышением потенциала этих методов являются недавно реализованные стратегии штрих-кодирования выбранных капсидов AAV на уровне ДНК и РНК, что позволяет проводить их всестороннюю и параллельную стратификацию in vivo во всех основных органах и типах клеток одного животного. Здесь мы представляем базовый конвейер, охватывающий этот набор дополнительных возможностей, используя пептидный дисплей AAV для представления разнообразного арсенала доступных технологий инженерии капсида. Соответственно, сначала мы описываем ключевые шаги по созданию библиотеки пептидных дисплеев AAV для отбора кандидатов in vivo с желаемыми свойствами, а затем демонстрируем, как штрих-кодировать наиболее интересные варианты капсида для вторичного скрининга in vivo . Далее мы проиллюстрируем методологию создания библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS), включая амплификацию штрих-кода и лигирование адаптеров, прежде чем завершить обзор наиболее важных шагов во время анализа данных NGS. Поскольку протоколы, представленные здесь, универсальны и адаптируемы, исследователи могут легко использовать их для обогащения оптимальных вариантов капсида AAV в своей любимой модели заболевания и для применения в генной терапии.
Introduction
Терапия переноса генов — это введение генетического материала в клетки для восстановления, замены или изменения клеточного генетического материала для предотвращения, лечения, лечения или улучшения заболевания. Перенос генов, как di vivo, так и ex vivo, зависит от различных систем доставки, невирусных и вирусных. Вирусы эволюционировали естественным образом, чтобы эффективно трансдуцировать свои клетки-мишени и могут использоваться в качестве векторов доставки. Среди различных типов вирусных векторов, используемых в генной терапии, все чаще используются аденоассоциированные вирусы из-за их недостаточной патогенности, безопасности, низкой иммуногенности и, что наиболее важно, их способности поддерживать долгосрочную, неинтегрирующую экспрессию 1,2,3. За последнее десятилетие генная терапия AAV принесла значительные достижения; три метода лечения были одобрены Европейским агентством по лекарственным средствам и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для использования у людей 3,4. Также проводится несколько клинических испытаний для лечения различных заболеваний, таких как гемофилия, мышечные, сердечные и неврологические заболевания, как рассмотрено в другом месте3. Несмотря на десятилетия прогресса, в последние годы область генной терапии пережила ряд неудач4, наиболее важным из которых были смерти в клиническихиспытаниях 5, которые были приостановлены из-за токсичности, ограничивающей дозу, особенно для тканей, которые являются массивными, такими как мышцы, или труднодоступными, такими как мозг6.
Векторы AAV, используемые в настоящее время в клинических испытаниях, относятся к естественным серотипам, за некоторыми исключениями:1. Инженерия AAV дает возможность разрабатывать векторы с превосходной органной или клеточной специфичностью и эффективностью. За последние два десятилетия было успешно применено несколько подходов, таких как пептидный дисплей, замена петли, перетасовка капсидной ДНК, подверженная ошибкам ПЦР и целевой дизайн, для создания отдельных вариантов AAV или их библиотек с различными свойствами7. Затем они подвергаются нескольким раундам направленной эволюции для выбора вариантов внутри них с желаемыми свойствами, как рассмотрено в другом месте 1,3. Из всех стратегий эволюции капсидов наиболее широко используются библиотеки AAV пептидных дисплеев благодаря некоторым уникальным свойствам: их относительно легко генерировать, и они могут достигать высокого разнообразия и высокой пропускной способности секвенирования, что позволяет отслеживать их эволюцию.
Первые успешные пептидные библиотеки AAV были описаны почти 20 лет назад. В одном из первых Perabo et al.8 построили библиотеку модифицированных капсидов AAV2, в которой пул случайно сгенерированных олигонуклеотидов был вставлен в плазмиду в положении, соответствующем аминокислоте 587 капсидного белка VP1, в тройной оси, выступающей из капсида. Используя коинфекцию аденовируса, библиотека AAV была разработана путем нескольких раундов отбора, и было показано, что окончательные ретаргетированные варианты способны трансдуцировать клеточные линии, рефрактерные к родительскому AAV28. Вскоре после этого Мюллер и др.9 представили двухступенчатую систему библиотечного производства, что значительно улучшило протокол. Первоначально библиотека плазмид вместе с аденовирусной вспомогательной плазмидой используется для получения библиотеки AAV, содержащей химерные капсиды. Эта челночная библиотека AAV используется для заражения клеток с низкой кратностью инфекции (MOI) с целью введения одного вирусного генома на клетку. Коинфекция аденовирусом обеспечивает выработку AAV с совпадающим геномом и капсидом9. Примерно десять лет спустя Dalkara10 использовала направленную эволюцию in vivo для создания варианта 7m8. Этот вариант имеет вставку 10 аминокислот (LALGETTRPA), три из которых действуют как линкеры и эффективно нацелены на внешнюю сетчатку после интравитреальной инъекции10. Этот инженерный капсид является исключительной историей успеха, так как это один из немногих инженерных капсидов, попавших в клинику на данный момент11.
Эта область пережила второй импульс с внедрением методов секвенирования следующего поколения (NGS). Две публикации от Adachi et al.12 в 2014 году и от Marsic et al.13 в 2015 году продемонстрировали возможности NGS для отслеживания распределения библиотек капсидов AAV со штрих-кодом с высокой точностью. Несколько лет спустя NGS областей со штрих-кодом был адаптирован к области введения пептидов, чтобы проследить эволюцию капсида. Körbelin et al.14 провели скрининг под контролем NGS для выявления капсида на основе AAV2, нацеленного на легкие. Анализ NGS помог рассчитать три рейтинговых балла: балл обогащения между отборочными раундами, общий балл специфичности для определения тканевой специфичности и, наконец, комбинированный балл14. В том же году лабораторияGradinaru 15 опубликовала систему целевой эволюции AAV (CREATE) на основе Cre-рекомбинации, которая облегчает отбор по типу клеток. В этой системе капсидная библиотека несет Cre-инвертируемый переключатель, так как сигнал polyA окружен двумя сайтами loxP. Затем библиотеку AAV вводят мышам Cre, где сигнал polyA инвертируется только в клетках Cre+, обеспечивая матрицу для связывания праймера обратной ПЦР с прямым праймером в гене капсида. Это высокоспецифическое спасение ПЦР позволило идентифицировать AAV-PHP. Вариант B, который может пересекать гематоэнцефалический барьер15. Эта система получила дальнейшее развитие в M-CREATE (Multiplexed-CREATE), в которой NGS и генерация синтетических библиотек были интегрированы в конвейер16.
Улучшенная версия этой системы на основе РНК из лабораторииМагуайра 17, iTransduce, позволяет отбирать на уровне ДНК капсиды, которые функционально трансдуцируют клетки и экспрессируют их геномы. Вирусный геном библиотеки пептидного дисплея включает ген Cre под контролем вездесущего промотора и ген капсида под контролем промотора p41. Библиотека вводится мышам, у которых есть кассета loxP-STOP-loxP перед tdTomato. Клетки, трансдуцированные вариантами AAV, которые экспрессируют вирусный геном и, следовательно, Cre экспрессируют tdTomato и в сочетании с клеточными маркерами могут быть отсортированы и отобраны17. Аналогичным образом, Nonnenmacher et al.18 и Tabebordbar et al.19 поместили библиотеку генов капсида под контроль тканеспецифических промоторов. После инъекции на разных животных моделях вирусная РНК использовалась для выделения вариантов капсида.
Альтернативным подходом является использование штрих-кодирования для маркировки библиотек капсидов. Лаборатория20 Бьорклунда использовала этот подход к библиотекам капсидов для вставки пептидов штрих-кода и разработала рациональную эволюцию вектора AAV со штрих-кодом (BRAVE). В одной плазмиде кассета Rep2Cap клонируется рядом с трансгеном с инвертированным концевым повтором (ITR), экспрессирующим желтый флуоресцентный белок (YFP), помеченным штрих-кодом. Используя сайты loxP между концом колпачка и началом штрих-кода, рекомбинация Cre in vitro генерирует фрагмент, достаточно маленький для NGS, тем самым позволяя ассоциировать вставку пептида с уникальным штрих-кодом (справочная таблица, LUT). Производство AAV осуществляется с использованием библиотеки плазмид, а штрих-коды, экспрессированные в мРНК, проверяются после применения in vivo , опять же с помощью NGS20. Когда библиотеки капсида содержат варианты всего гена капсида (т.е. перетасованные библиотеки), необходимо использовать секвенирование с длинным чтением. Несколько групп использовали штрих-коды для маркировки этих разнообразных библиотек, что позволяет NGS иметь более высокую глубину считывания. ЛабораторияКея 21 пометила очень разнообразные перетасованные капсидные библиотеки штрих-кодами после сигнала cap polyA. На первом этапе была сгенерирована библиотека плазмид со штрих-кодом, и в нее была клонирована перетасованная библиотека генов капсида. Затем для генерации LUT21 была использована комбинация MiSeq (короткое чтение, более высокая глубина чтения) и PacBio (длинное чтение, меньшая глубина чтения), а также секвенирование Сэнгера. В 2019 году Огден и его коллеги из лабораторииЧерча 22 определили пригодность капсида AAV2 для нескольких функций, используя библиотеки, которые имели одноточечные мутации, вставки и делеции в каждой позиции, что в конечном итоге позволило использовать машинно-управляемое проектирование. Для генерации библиотеки были синтезированы меньшие фрагменты гена капсида, помечены штрих-кодом, секвенированы следующего поколения, а затем клонированы в ген полного капсида. Данные NGS были использованы для создания LUT. Затем библиотека была проверена с использованием только штрих-кодов и короткой последовательности считывания, что, в свою очередь, обеспечивает более высокую глубину считывания22.
Библиотеки со штрих-кодом в основном использовались для скрининга пула известных, естественных и инженерных вариантов после нескольких раундов отбора библиотек капсида или независимо от исследования эволюции капсида. Преимуществом таких библиотек является возможность скрининга нескольких капсидов, при этом сокращая количество животных и сводя к минимуму различия между животными. Первые исследования, которые представили эту технологию в области AAV, были опубликованы почти десять лет назад. Лаборатория Накаи 12 пометила 191 двойного аланинового мутанта, охватывающего аминокислоты с 356 по 736 на VP1 из AAV9 парой 12-нуклеотидных штрих-кодов. С помощью NGS библиотека была проверена in vivo на связывание галактозы и другие свойства12. Марсик и его коллеги очертили биораспределение вариантов AAV, используя также анализ с двойным шнуром 1 год спустя13. В более позднем исследовании, проведенном на нечеловекообразных приматах, сравнивалось биораспределение в центральной нервной системе 29 капсидов с использованием различных путей доставки23. Наша лаборатория недавно опубликовала библиотечные экраны AAV со штрих-кодом из 183 вариантов, которые включали натуральные и инженерные AAV. Эти скрининги на уровне ДНК и РНК привели к идентификации высокомиотропного вариантаAAV 24 у мышей, а также других, демонстрирующих высокую специфичность клеточного типа в мозгемыши 25.
Здесь мы описываем методологию, используемую в этой работе, и расширяем ее, включая скрининг библиотек пептидных дисплеев AAV. Это включает в себя создание библиотек пептидных дисплеев AAV2, метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для количественной оценки и, наконец, конвейер NGS для анализа вариантов AAV, частично основанный на работе Вайнманна и его коллег24. Наконец, приводится описание генерации библиотек AAV со штрих-кодом и конвейера NGS, используемых в той же публикации.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе изложены этапы, необходимые для разработки капсида AAV на пептидных дисплеях и для скрининга библиотек AAV со штрих-кодом, а также для биоинформатического анализа состава библиотеки и характеристик капсида. Этот протокол фокусируется на шагах, которые облегчают биоинфор…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. высоко ценит поддержку со стороны Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) через Центры совместных исследований DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) и TRR179 (Projektnummer 272983813), а также Немецкого центра инфекционных исследований (DZIF, BMBF; ТТУ-ВИЧ 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
Riferimenti
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
- Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
- Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621 (2022).
- Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756 (2022).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
- Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
- Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075 (2014).
- Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041 (2015).
- Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
- Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
- Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
- Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
- Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
- Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
- Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
- Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432 (2020).
- Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
- Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
- Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819 (2012).
- Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
- Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899 (2017).
- Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
- Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
- Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
- Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
- Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272 (2013).
- Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
- Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200 (2017).
- Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
- Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
- Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825 (2021).
