Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)
Summary
Geração de biblioteca de exibição de peptídeos AAV e posterior validação através do código de barras de candidatos com novas propriedades para a criação de AAVs de próxima geração.
Abstract
Os vetores de liberação gênica derivados do vírus adenoassociado (AAV) são uma das ferramentas mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas, evidenciada por dados clínicos encorajadores e pela aprovação de várias terapias gênicas com AAV. Duas razões principais para o sucesso dos vetores AAV são (i) o isolamento prévio de vários sorotipos virais naturais com propriedades distintas, e (ii) o subsequente estabelecimento de tecnologias poderosas para sua engenharia molecular e reaproveitamento em alto rendimento. Aumentando ainda mais o potencial dessas técnicas são recentemente implementadas estratégias para a codificação de barras-capsídeos AAV selecionados no nível de DNA e RNA, permitindo sua estratificação in vivo abrangente e paralela em todos os principais órgãos e tipos celulares em um único animal. Aqui, apresentamos um pipeline básico que engloba esse conjunto de vias complementares, usando a exibição de peptídeos AAV para representar o arsenal diversificado de tecnologias de engenharia de capsídeos disponíveis. Assim, primeiro descrevemos as etapas fundamentais para a geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV para a seleção in vivo de candidatos com propriedades desejadas, seguido por uma demonstração de como codificar as variantes de capsídeos mais interessantes para triagem secundária in vivo. Em seguida, exemplificamos a metodologia para a criação de bibliotecas para sequenciamento de próxima geração (NGS), incluindo amplificação de código de barras e ligadura de adaptador, antes de concluir com uma visão geral das etapas mais críticas durante a análise de dados NGS. Como os protocolos relatados aqui são versáteis e adaptáveis, os pesquisadores podem facilmente aproveitá-los para enriquecer as variantes ideais do capsídeo AAV em seu modelo de doença favorito e para aplicações de terapia gênica.
Introduction
A terapia de transferência gênica é a introdução de material genético nas células para reparar, substituir ou alterar o material genético celular para prevenir, tratar, curar ou melhorar doenças. A transferência de genes, tanto in vivo quanto ex vivo, depende de diferentes sistemas de entrega, não virais e virais. Os vírus evoluíram naturalmente para transduzir eficientemente suas células-alvo e podem ser usados como vetores de entrega. Dentre os diferentes tipos de vetores virais empregados na terapia gênica, os vírus adenoassociados têm sido cada vez mais utilizados, devido à sua falta de patogenicidade, segurança, baixa imunogenicidade e, principalmente, sua capacidade de sustentar a expressão não integradora a longo prazo 1,2,3. A terapia gênica com AAV produziu conquistas consideráveis na última década; três terapias foram aprovadas pela Agência Europeia de Medicamentos e pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para uso em humanos 3,4. Vários ensaios clínicos também estão em andamento para tratar uma variedade de doenças, como hemofilia, doenças musculares, cardíacas e neurológicas, conforme revisado em outros estudos3. Apesar de décadas de avanço, o campo da terapia gênica tem experimentado uma série de contratempos nos últimos anos4 e, principalmente mortes em ensaios clínicos5 que foram suspensas devido a toxicidades limitantes da dose, particularmente para tecidos maciços, como o músculo, ou de difícil acesso, como océrebro6.
Os vetores do AAV atualmente utilizados em ensaios clínicos pertencem aos sorotipos naturais, com algumas exceções1. A engenharia AAV oferece a oportunidade de desenvolver vetores com especificidade e eficiência superior de órgãos ou células. Nas últimas duas décadas, várias abordagens têm sido aplicadas com sucesso, tais como exibição de peptídeos, loop-swap, embaralhamento de DNA do capsídeo, PCR propenso a erros e design direcionado, para gerar variantes individuais de AAV ou bibliotecas com propriedades diversas7. Estes são então submetidos a múltiplas rodadas de evolução dirigida para selecionar as variantes dentro deles com as propriedades desejadas, conforme revisado em outro artigo 1,3. De todas as estratégias de evolução do capsídeo, as bibliotecas AAV de exibição de peptídeos têm sido as mais utilizadas, devido a algumas propriedades únicas: são relativamente fáceis de gerar, e podem alcançar alta diversidade e sequenciamento de alto rendimento, o que permite acompanhar sua evolução.
As primeiras bibliotecas de AAV de inserção peptídica bem-sucedidas foram descritas há quase 20 anos. Em um dos primeiros, Perabo et al.8 construíram uma biblioteca de capsídeos AAV2 modificados, na qual um pool de oligonucleotídeos gerados aleatoriamente foi inserido em um plasmídeo em uma posição que corresponde ao aminoácido 587 da proteína VP1 capsídeo, no eixo de três vezes saliente do capsídeo. Usando a co-infecção de adenovírus, a biblioteca de AAV foi evoluída através de várias rodadas de seleção, e as variantes finais redirecionadas mostraram-se capazes de transduzir linhagens celulares refratárias ao AAV2 parental8. Pouco tempo depois, Müller et al.9 introduziram o sistema de duas etapas para a produção de bibliotecas, uma melhoria significativa do protocolo. Inicialmente, a biblioteca de plasmídeos, juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral, são usados para produzir uma biblioteca de AAV que contém capsídeos quiméricos. Esta biblioteca de transporte AAV é usada para infectar células com baixa multiplicidade de infecção (MOI), com o objetivo de introduzir um genoma viral por célula. A co-infecção com adenovírus garante a produção de AAVs com genoma e capsídeo9 correspondentes. Cerca de uma década depois, Dalkara10 usou a evolução dirigida in vivo para criar a variante 7m8. Essa variante possui inserção de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), três dos quais atuam como ligantes, e atingem eficientemente a retina externa após injeção intravítrea10. Este capsídeo projetado é uma história de sucesso excepcional, pois é um dos poucos capsídeos projetados a chegar à clínica até agora11.
O campo experimentou um segundo impulso com a introdução de técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS). Duas publicações de Adachi et al.12, em 2014, e de Marsic et al.13, em 2015, mostraram o poder da NGS para rastrear a distribuição de bibliotecas de capsídeos AAV com código de barras com alta precisão. Alguns anos depois, a NGS das regiões com código de barras foi adaptada à região de inserção do peptídeo para acompanhar a evolução do capsídeo. Körbelin et al.14 realizaram uma triagem guiada por NGS para identificar um capsídeo baseado em AAV2 direcionado para a pulmonar. A análise da NGS ajudou a calcular três escores de avaliação: o escore de enriquecimento entre as rodadas de seleção, o escore de especificidade geral para determinar a especificidade tecidual e, finalmente, o escore combinado14. O laboratório Gradinaru15 publicou o sistema de evolução direcionada AAV baseado em recombinação Cre (CREATE) no mesmo ano, o que facilita uma seleção específica do tipo de célula. Neste sistema, a biblioteca capsid carrega um switch Cre-invertible, já que o sinal polyA é flanqueado por dois sites loxP. A biblioteca AAV é então injetada em camundongos Cre, onde o sinal poliA é invertido apenas em células Cre+, fornecendo o molde para a ligação de um primer de PCR reverso com o primer forward dentro do gene do capsídeo. Este resgate por PCR altamente específico possibilitou a identificação do AAV-PHP. Variante B que pode atravessar a barreira hematoencefálica15. Este sistema evoluiu ainda para o M-CREATE (Multiplexed-CREATE), no qual NGS e geração de bibliotecas sintéticas foram integradas no pipeline16.
Uma versão melhorada desse sistema baseada em RNA do laboratório Maguire17, o iTransduce, permite a seleção no nível de DNA de capsídeos que transduzem funcionalmente as células e expressam seus genomas. O genoma viral da biblioteca de exibição de peptídeos compreende um gene Cre sob o controle de um promotor ubíquo e o gene do capsídeo sob o controle do promotor p41. A biblioteca é injetada em ratos que têm um loxP-STOP-loxP a montante de tdTomato. Células transduzidas com variantes do AAV que expressam o genoma viral e, portanto, Cre expressam tdTomato e, em combinação com marcadores celulares, podem ser classificadas e selecionadas17. Da mesma forma, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et al.19 colocaram a biblioteca gênica do capsídeo sob o controle de promotores tecido-específicos. Após injeção em diferentes modelos animais, o RNA viral foi usado para isolar as variantes do capsídeo.
Uma abordagem alternativa é usar código de barras para marcar bibliotecas de capsídeos. O laboratório de Björklund20 usou essa abordagem para bibliotecas de capsídeos de inserção de peptídeos de código de barras e desenvolveu a evolução vetorial AAV racional com código de barras (BRAVE). Em um plasmídeo, o Rep2Cap é clonado ao lado de um transgene marcado com código de barras e repetições terminais invertidas (ITR), com expressão de proteína fluorescente amarela (YFP). Usando sítios loxP entre o final da tampa e o início do código de barras, uma recombinação de Cre in vitro gera um fragmento pequeno o suficiente para NGS, permitindo assim a associação da inserção do peptídeo com o código de barras único (look-up table, LUT). A produção de AAV é realizada utilizando a biblioteca de plasmídeos e os códigos de barras expressos no RNAm são triados após aplicação in vivo , novamente com NGS20. Quando as bibliotecas do capsídeo compreendem variantes de todo o gene do capsídeo (ou seja, bibliotecas embaralhadas), o sequenciamento de leitura longa precisa ser usado. Vários grupos têm usado códigos de barras para marcar essas diversas bibliotecas, o que permite NGS com maior profundidade de leitura. O laboratório Kay21 marcou bibliotecas embaralhadas de capsídeos altamente diversos com códigos de barras a jusante do sinal poliA da tampa . Em uma primeira etapa, uma biblioteca de plasmídeos com código de barras foi gerada, e a biblioteca de genes do capsídeo embaralhada foi clonada nela. Em seguida, uma combinação de MiSeq (leitura curta, maior profundidade de leitura) e PacBio (leitura longa, menor profundidade de leitura), NGS e sequenciamento de Sanger foram usados para gerar sua LUT21. Em 2019, Ogden e colegas do laboratório da Igreja22 delinearam a aptidão do capsídeo AAV2 para múltiplas funções usando bibliotecas que tinham mutações de ponto único, inserções e exclusões em todas as posições, o que finalmente permitiu o design guiado por máquina. Para a geração da biblioteca, fragmentos menores do gene do capsídeo foram sintetizados, marcados com um código de barras, sequenciados de próxima geração e, em seguida, clonados no gene completo do capsídeo. Os dados de NGS foram usados para gerar uma LUT. A biblioteca foi então triada utilizando-se apenas os códigos de barras e o sequenciamento de leitura curta, o que, por sua vez, permite maior profundidade de leitura22.
As bibliotecas com código de barras têm sido predominantemente usadas para selecionar um conjunto de variantes conhecidas, naturais e projetadas após várias rodadas de seleção de bibliotecas de capsídeos ou independentes de um estudo de evolução de capsídeos. A vantagem de tais bibliotecas é a oportunidade de rastrear vários capsídeos, reduzindo o número de animais e minimizando a variação entre os animais. Os primeiros estudos que introduziram essa tecnologia no campo dos AAV foram publicados há quase uma década. O laboratório Nakai 12 marcou 191 mutantes duplos de alanina cobrindo aminoácidos 356 a 736 no VP1 de AAV9 com um par de códigos de barras de12 nucleotídeos. Usando NGS, a biblioteca foi triada in vivo para ligação de galactose e outras propriedades12. Marsic e colaboradores delinearam a biodistribuição de variantes do AAV usando também uma análise de barra dupla 1 ano depois13. Um estudo mais recente em primatas não humanos comparou a biodistribuição no sistema nervoso central de 29 capsídeos utilizando diferentes vias de parto23. Nosso laboratório publicou recentemente telas de biblioteca AAV com código de barras de 183 variantes que incluíam AAVs naturais e projetados. Essas telas no nível de DNA e RNA levaram à identificação de uma variante altamente miotrópica do AAV24 em camundongos, bem como outras exibindo uma alta especificidade do tipo celular no cérebro de camundongos25.
Aqui, descrevemos a metodologia usada neste trabalho e a expandimos para incluir a triagem de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV. Isso compreende a geração de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV2, um método de PCR digital em gotículas (dd-PCR) para quantificação e, finalmente, um pipeline NGS para analisar as variantes do AAV, baseado em parte no trabalho de Weinmann e colaboradores24. Finalmente, uma descrição da geração de bibliotecas AAV com código de barras e do pipeline NGS usado na mesma publicação é fornecida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, são descritas as etapas necessárias para a engenharia do capsídeo AAV de exibição de peptídeos e para a triagem de bibliotecas de AAV com código de barras, bem como para a análise bioinformática da composição da biblioteca e do desempenho do capsídeo. Este protocolo se concentra nas etapas que facilitam a análise bioinformática desses tipos de bibliotecas, porque a maioria dos laboratórios de virologia tem atraso em habilidades de programação para corresponder à sua proficiência em té…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. agradece muito o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) através dos Centros de Pesquisa Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), bem como do Centro Alemão de Pesquisa de Infecção (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
Riferimenti
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